ＭＡＧＥ－３基因ｍＲＮＡ的表达在胸腔积液鉴别诊断中的价值

［摘 要］

目的 研究MAGE-3基因mRNA在胸腔积液中的表达，探讨MAGE-3基因作为良、恶性胸腔积液鉴别诊断指标的价值。

方法 采用巢式逆转录-聚合酶链反应（nRT-PCR）方法，检测35例患者（25例恶性，10例良性）胸腔积液中MAGE-3的表达情况。

结果 10例良性胸腔积液组中，均未见有MAGE-3特异性条带；25例恶性胸腔积液组中，有14例可见MAGE-3特异性扩增条带，MAGE-3基因表达阳性率为56.00％，其敏感性、特异性、诊断符合率分别为56.00％、100.00％、68.57％。

结论 检测胸腔积液中MAGE-3基因mRNA的表达，可以作为鉴别良、恶性胸腔积液的一个指标。

［关键词］ 肺癌；MAGE-3基因；胸腔积液；巢式逆转录-聚合酶链反应

［中图分类号］ R561.3［文献标识码］ A［文章编号］ 1672-4208(2008)11-0001-03

The Value of MAGE-3 mRNA Expression in Pleural Effusion in Differential Diagnosis of Benign and M alignant Pleural EffusionLIU Jing,YUE Hong-mei,HU Quan.The First Hospital of Lanzhou University, Department of Respiratory,Lanzhou 730000,China

【Abstract】 Objective This research was to detect whether the differential expression profile of the MAGE-3 mRNA occurred in pleural effusion, and to explore the feasibility of MAGE-3 gene detection as a diagnostic marker for benign and m alignant pleural effusion.

Methods MAGE-3 mRNA in pleural effusion was detected by nested RT-polymerase chain reaction (nRT-PCR) in 35 cases of patients (25 m alignants and 10 benigns) complicating pleural effusion.

Results No MAGE-3 expression in pleural effusion of 10 patients complicating benign pleural effusion. As opposed to the benign controls, out of the 25 patients complicating m alignant pleural effusion, 14 ases of MAGE-3 expression amplification strap were observed in pleural effusion and the rate of positive, sensitivity, specificity, accuracy were 56.00%,56.00%,100.00%,68.57% to part.

Conclusion To detect MAGE-3 mRNA of pleural effusion might be a valuable diagnostic indicator for benign and m alignant pleural effusion.

【Key words】 Lung cancer；Melanoma-associated antigen-3 gene；Pleural effusion；nRT-PCR

胸腔积液是一种常见临床征象，其中，结核性胸腔积液和恶性胸腔积液发病率较高，鉴别十分困难。且胸腔积液的诊断与治疗、预后密切相关。目前，临床上常见的鉴别方法是脱落细胞检查找癌细胞，但其阳性率不高，易导致漏诊。本实验研究MAGE-3基因mRNA在胸腔积液中的表达，并探讨MAGE-3基因作为良、恶性胸腔积液鉴别诊断指标的价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床资料 2007年2月～2007年10月兰州大学第一医院收住的35例住院患者的胸腔积液。其中男性19例，女性16例；患者年龄21～78岁，平均年龄49岁。良性胸腔积液组：共10例，男5例，女5例，平均年龄39岁，根据病史、体征、胸部X线、胸腔积液常规化验及正规抗结核治疗并经随访胸腔积液完全吸收并除外其它病因等诊断为结核性胸腔积液者7例；经细菌病理学等检查可排除肿瘤的肺炎3例。恶性胸腔积液组：共25例，男14例，女11例，平均年龄48岁，经组织病理学（纤维支气管镜活检、经皮肺活检、胸膜活检、淋巴结活检等）、胸腔积液细胞学诊断恶性胸腔积液，其中包括肺癌21例（鳞癌9例、腺癌5例、胸膜间皮瘤2例、腺鳞癌1例、大细胞未分化癌3例、小细胞癌1例），转移卵巢癌2例，转移前列腺癌2例。

1.1.2 主要试剂 所用试剂Trizol裂解液、AMV第一链cDNA合成试剂盒、Taq DNA聚合酶、Low MW DNA marker-A等均购自上海生工生物工程服务有限公司，其他分析试剂为国产分析纯。

1.1.3 引物设计与合成 参照GenBank设计两对引物，见表1。

1.1.4 主要仪器 B160A型医用低速离心机、Heraeus离心机（德国）、PCR仪（德国Biometra公司）、DYY-6B型稳压稳流电泳仪、WFH-201B紫外反射投射仪、Kodak凝胶图象分析仪等。

1.2 MAGE-3基因mRNA表达的测定

1.2.1 标本的采集及总RNA的提取 用高压灭菌并加有EDTA的250 ml盐水瓶收集胸腔积液200 ml，另抽100 ml送病理科行细胞学检查。将标本立即离心（1500 g，10分钟；PBS缓冲液冲洗两次，1500 g,5分钟），弃上清获得沉淀，沉淀中加1 ml Trizol(上海生产)裂解液，经氯仿分层，等体积异丙醇沉淀，75％乙醇洗涤，室温干燥，0.1％的焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解，经变性琼脂糖凝胶电泳分析。

1.2.2 cDNA的合成20 μl反应体系加入3.5 μl总RNA、随即引物1 μl、AMV逆转录酶1 μl、RNasin 1 μl等，37℃水浴60 min，所得逆转录产物cDNA保存于－70℃超低温冰箱备用（参照上海生产AMV逆转录聚合酶链反应试剂盒说明书操作）。

1.2.3 MAGE-3基因的PCR扩增（50 μl反应体系） 第一轮PCR扩增:5 μl逆转录产物，加入0.5 μl Taq DNA聚合酶，扩增片段长度为423 bp,于PCR热循环仪中扩增30个循环（95℃60 s，56℃30 s，72℃30 s）72延伸10 min。第二轮PCR扩增：5 μl第一轮PCR扩增产物，加入0.5 μl Taq DNA聚合酶，扩增片段长度为235 bp,于PCR热循环仪中扩增40个循环（95℃60 s，56℃30 s，72℃30 s）72延伸10 min。引物序列见表1。

1.2.4 PCR产物电泳 取PCR产物10 μl，经溴化乙啶染色，GM331(Low MW DNA)作为Marker，进行2%琼脂糖凝胶电泳， Kodak凝胶图象分析仪分析并与Marker比较，阳性带为MAGE-3基因,并照相。

1.3 统计学处理计数资料用阳性例数或阳性率表示，分类变量间比较采用了χ²检验。P值<0.05有统计学意义。运算过程采用SPSS10.0统计软件包处理。

2 结果

2.1 MAGE-3基因的表达情况 在25例恶性胸腔积液组中，有14例可见MAGE-3特异性扩增条带，MAGE-3基因表达阳性率为56.00％；10例良性胸腔积液组中，均未见有MAGE-3特异性条带。其敏感性、特异性、诊断符合率分别为56.00％、100.00％、68.57％。经Fisher’s确切概率检验，P<0.01,良性、恶性PE间MAGE-3的阳性率差异有统计学意义。

2.2 两种检测方法的比较 本实验25例恶性胸腔积液中，8例细胞学检查阳性，阳性率为32.00％；MAGE-3基因检测14例阳性，阳性率56.00%。经χ²检验,P<0.05，两种检测方法阳性率差异有统计学意义。

2.3 MAGE-3基因nRT-PCR产物电泳结果 M泳道为Low MW DNA Maker（25～500 bp）,最前方条带分子量为100 bp,依次为200、300、400、500、600 bp； 1、3泳道阳性带为恶胸腔积液中MAGE-3mRNA经nRT-PCR扩增得到的DNA。随机抽取1例PCR扩增产物标本，与Genebank中公布的MAGE-3序列比较显示，所扩增的约235 bp基因片段为MAGE-3基因，证实该条带为MAGE-3基因DNA。2、4泳道为良性胸腔积液中MAGE-3mRNA经nRT-PCR扩增情况，未见阳性条带，即良性标本中未检测到MAGE-3基因表达。

3 讨论

黑色素瘤抗原 (melanoma-associated antigen, MAGE)是Van等^[1]于1991年在黑色素瘤细胞系中首次发现的一种新的肿瘤特异性抗原(tumor-specificitied antigen, TSA)。MAGE基因通常只在睾丸、胎盘^[2-4]等少数正常组织中表达，而在多数肿瘤组织中有异常高表达。许多MAGE家族基因被报道在肺癌组织中有表达^[5-8]。Jang. SJ^[9]对早期非小细胞肺癌及未患肺癌且有吸烟史的正常人行支气管刷检，发现两者MAGE基因表达均上调，其家族中的MAGE-3表达阳性率为45％，且研究显示，MAGE-3的免疫原性最强。

目前良、恶性胸水鉴别依然很困难。临床表现、诊断性胸腔穿刺、胸膜活检、胸腔镜、气管镜等都是良、恶性胸腔积液的鉴别诊断方法，其中胸腔积液中查到癌细胞或取得组织学检查是诊断恶性胸腔积液的金标准，研究显示，细胞学检查能确诊37％～60％的恶性胸腔积液^[10]，其特异性高，但胸腔积液中找癌细胞单次检验阳性率低，加之脱落的间皮细胞随脱落时间延长发生退行性改变给肿瘤细胞的鉴别带来了困难。而胸腔积液临床生化学检查、细胞因子检查等检查因受多种因素影响敏感性较低。

自Van^[11]等1991年发现MAGE-A1后十几年间，该家族的新成员不断被发现。到目前为止，50多个MAGE相关基因已被确定。根据其基因在染色体上的定位不同而分为四个亚科（MAGE-A (Xq28)、-B (Xq21.3)、-C (Xq26)、-D (Xq11.23))。MAGE基因除在睾丸、胎盘等少数正常组织中表达外，在多数肿瘤组织中有异常高表达，称为高度限制性表达。研究表明睾丸、胎盘这些组织细胞中不表达主要组织相容复合物（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ类分子，虽有MAGE等基因的表达，但抗原不能被加工提呈于睾丸细胞表面，因而不会被自身细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)识别而受到攻击。同时血－睾丸屏障的存在，阻断了白细胞与生殖细胞的接触，因而表达MAGE抗原的生殖细胞不会诱导体内的免疫应答。MAGE基因家族中的MAGE-3的免疫原性最强，表达率最高，因而成为疫苗接种的靶基因。在MAGE-A3蛋白分子内（目前已知）至少有5个MHCⅠ类分子限制性表位和6个MHCⅡ类分子限制性表位。经由相应的MHCⅠ类或MHCⅡ分子递呈给CD8(+)或CD4(+)T细胞，使人体产生针对表达MAGE-3的肿瘤的细胞免疫^[12]。Thurner等用MAGE-3A1负载树突状细胞，用于治疗Ⅳ期黑色素瘤患者，研究结果提示负载MAGE抗原的树突状细胞可以扩增特异性的CTL，甚至在晚期癌症患者中也可以使肿瘤退变。因此，对MAGE-3的研究具有临床意义及应用价值。MAGE家族基因在乳腺癌、子宫内膜癌、食管癌、肝癌、前列腺癌、结直肠癌均有不同程度表达。因此临床上对外周血、浆膜腔液等原发病灶以外的组织中MAGE的检测，对肿瘤发生、发展、转移的预测，在疾病的诊断、治疗上有着重要意义。

通过本实验我们发现良性胸腔积液中未见MAGE-3基因表达，这与Van等报道的该基因作为一种肿瘤标志物仅表达于恶性肿瘤组织中相一致，这说明在结核性胸水和炎性胸水中该基因不表达，该基因在判断胸腔积液良、恶性方面有较高的特异性，假阳性率为0。研究表明^[13]检测体液中的MAGE的含量，有助于发现少量肿瘤细胞的存在。本实验25例恶性胸腔积液标本中，细胞学查瘤细胞检查阳性者为8例，敏感性为32.00％，低于MAGE-3基因表达的检测阳性率。原因可能是胸腔积液中肿瘤细胞较少，或病因不同所致恶性胸液癌细胞阳性率差异（如肺腺癌高达85%～100%,肺鳞癌仅4%～25%），或者细胞形态学上不典型给检查者的鉴别带来困难。比较而言，核酸的保存时间较长，PCR实验条件十分成熟，检测敏感性高。本实验检测恶性胸腔积液中MAGE-3基因的表达阳性率较高，且高于Jang SJ^[9]等的报道，可能与我们采用的巢式RT-PCR敏感性高有关。本研究表明，使用nRT－PCR方法检测胸腔积液中MAGE-3基因mRNA的表达，在恶性胸腔积液的鉴别诊断中特异性高，敏感性较细胞学检查更高，且方法简单，易于推广应用，具有较高的实用价值。适于作为一项检查方法推广应用。

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（收稿日期：2008-01-11）

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