拮抗木霉菌株T32的紫外线诱变改良

摘要：采用紫外线诱变处理与含药（百菌清）培养基驯化相结合的方法，对拮抗木霉菌株Ｔ３２进行改良，获得了４株在百菌清杀菌剂２ ０００ ｍｇ／Ｌ浓度水平下仍能较好生长的抗性菌株，并通过测定其生长速率、产孢量、敏感性、拮抗作用以及遗传稳定性等指标，筛选出了性状优良的抗性菌株Ｔ３２－５－１０ｍ。试验结果表明，经诱变的木霉菌株Ｔ３２－５－１０ｍ与亲本木霉菌株Ｔ３２相比较，其抗药性提高了２０倍，生长速率和产孢能力均高于亲本菌株，连续转接１０代，其抗药性十分稳定，且对供试３种土传病原真菌的抑制率达８７．５６%～８９．１１％。

关键词：紫外线诱变；拮抗木霉菌株Ｔ３２；百菌清；抗药性

中图分类号： 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）01－0044-04

Improvement of Antagonistic Trichoderma Strain T32 by Ultraviolet Mutation

ＫＡＮＧ Ｐｉｎｇ－ｚｈｉ，ＺＨＡＮＧ Ｌｉ－ｒｏｎｇ

（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，Ｎｉｎｇｘｉａ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ / Ｎｉｎｇｘｉａ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｐｅｓｔ，Ｙｉｎｃｈｕａｎ ７５０００２，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｔｒａｉｎ Ｔ３２ ｗａｓ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｂｙ ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈｌｏｒｏｔｈａｌｏｎｉｌ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ． ４ ｃｈｌｏｒｏｔｈａｌｏｎｉｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｇｒｏｗ ｗｅｌｌ ｗｈｅｎ ｃｈｌｏｒｏｔｈａｌｏｎｉｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ２ ０００ ｍｇ／Ｌ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ． Ａ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｓｔｒａｉｎ Ｔ３２－５－１０ｍ ｗｉｔｈ ｇｏｏｄ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｗａｓ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｂｙ ｔｅｓｔｉｎｇ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ， ｓｐｏｒｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｙｉｅｌｄ， ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ， ｃｏｕｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ， ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｐａｒｅｎｔ ｓｔｒａｉｎ Ｔ３２， ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ Ｔ３２－５－１０ｍ ｗａｓ ｒａｉｓｅｄ ｂｙ ２０ ｔｉｍｅｓ； ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ ａｎｄ ｓｐｏｒｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ３２－５－１０ｍ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ Ｔ３２． Ｔｈｅ ｍｅｄｉｃａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ Ｔ３２－５－１０ｍ ｗａｓ ｓｔｅａｄｙ ａｆｔｅｒ １０ ｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅｓ， ａｎｄ ｉｔｓ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ ａｇａｉｎｓｔ ３ ｓｏｉｌ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｗａｓ ８７．５6％～８９．１１％．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ mutation； ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ Ｔ３２； ｃｈｌｏｒｏｔｈａｌｏｎｉｌ； ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ

拮抗木霉菌（Ｔｈｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．）是目前国内外研究最为广泛的一种生防菌。据报道，它至少对１８属２９种病原真菌具有抑制作用，尤其对作物土传病原真菌具有显著的抑制效果，是一种十分有潜力的生防菌。目前，国内外已有商品化木霉制剂，且多为孢子活菌制剂，但常受到田间温度、雨水及化学农药等多种环境因素的干扰，导致防治效果不太理想。因此，需要将野生木霉菌株加以改良，选育出对化学农药具有高度抗药性等性状优良的突变型菌株，既可提高木霉制剂的生防效果，又可实现生物农药与化学农药的协同作用。目前，生防菌株的改良方法主要有诱变育种、原生质体融合以及遗传改造等［１－４］，其中诱变育种技术是提高菌株生产能力的重要手段，可选育多种优良突变体和新的有益基因类型。本文采用紫外线诱变和含药培养基驯化相结合的方法，旨在选育出生长速度快、产孢量高、后代稳定性好的高度抗药性木霉突变菌株，为今后生防木霉制剂的研制及开发奠定坚实的基础。

１ 材料与方法

１．１ 材料

１．１．１ 供试菌株 拮抗木霉菌（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．）Ｔ３２是从宁夏１４个市县大量采集不同作物和不同种植方式的农耕土、不同植被土壤以及各类植物残体、腐物和动物粪便等样品中经分离、纯化，对峙培养筛选得到［５］。病原菌黄瓜枯萎病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ． ｓｐ． ｃｕｃｕｍｅｒｉｎｕｍ）、辣（甜）椒疫霉病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｐｓｉｃｉ Ｌｅｏｎｉａｎ）、立枯丝核菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）经本实验室常规分离和纯化得到，用ＰＤＡ培养基在１～４ ℃冰箱中保存备用。

１．１．２ 供试药剂 ７５％达科宁（百菌清）可湿性粉剂（先正达作物保护有限公司）。

１．１．３ 实验仪器 光学显微镜ＬＥＩＣＡＤＭ２０００、ＨＺＱ－Ｃ空气浴恒温振荡器、ＲＸＺ型智能人工气候箱、ＳＷ－ＣＪ－ＩＢＵ洁净工作台、ＦＡ／ＪＡ电子天平、血球计数板。

１．１．４ 培养基 ＰＤＡ培养基：马铃薯２００ ｇ，葡萄糖２０ ｇ，去离子水１ ０００ ｍL，１０ ｇ琼脂粉。药物培养基：把ＰＤＡ培养基熔化后，按试验需要量加入定量７５％百菌清可湿性粉剂混合均匀倒入平板。

１．２ 方法

１．２．１ 拮抗木霉Ｔ３２菌悬液过滤材料的选择及菌悬液制备［６］ 在ＰＤＡ培养基上接种拮抗木霉菌株Ｔ３２，

２５ ℃恒温培养５ ｄ，待产生大量绿色孢子后，用去离子水洗刷培养好的木霉菌落２皿，装入１００ ｍL三角瓶制成菌悬液，置于摇床上振荡１５ ｍｉｎ后取出，分别用脱脂棉、擦镜纸和微孔滤膜（孔径０．４５ μｍ、规格１５０ ｍｍ）过滤菌悬液，用血球计数板在显微镜下记录观察结果，并比较其过滤效果。将振荡菌悬液用上述筛选出的过滤材料过滤后制成分生孢子悬浮液，其含量达到 ８×１０９ CFU／ｍL，备用。

１．２．２ 拮抗木霉Ｔ３２的诱变改良［７，８］

１）拮抗木霉Ｔ３２的紫外线诱变。取上述木霉分生孢子悬浮液在含７５％百菌清可湿性粉剂１００ ｍｇ／Ｌ的ＰＤＡ培养基上均匀涂布０．１ ｍL／皿，去皿盖于２０ W紫外灯管下３０ ｃｍ处避开外界光进行照射后，立即把平板用牛皮纸包好，且外包双层黑布，放入黑暗的２５ ℃培养箱中培养，设１、３、５、７、１０、１５、２０ ｍｉｎ共７个照射时间处理，培养５～７ ｄ后检查经诱变处理的Ｔ３２在平板上生长的菌落，选择生长速度快的菌落转移到含７５％百菌清可湿性粉剂 ２００ ｍｇ／Ｌ的ＰＤＡ培养基上培养。

２）含药（百菌清）培养基驯化。在含７５％百菌清可湿性粉剂２００ ｍｇ／Ｌ的ＰＤＡ培养基上２５ ℃恒温培养木霉菌落５～７ ｄ后，选取生长速度快的突变型木霉菌株，在菌落边缘取直径６ ｍｍ菌饼，接种到含７５％百菌清可湿性粉剂３００ ｍｇ／Ｌ的ＰＤＡ平板上，２５ ℃恒温培养７ ｄ。按照此方法依次类推，逐步提升百菌清浓度至２ ０００ ｍｇ／Ｌ的ＰＤＡ平板上，直到获得高度抗药性木霉突变菌株。

１．２．３ 抗药性木霉突变菌株生长速率及产孢能力测定 将经紫外线诱变及含药培养基驯化得到的抗药性木霉菌株分别接种在ＰＤＡ平板中央，于２５ ℃恒温黑暗培养，用十字交叉法分别于１ ｄ、２ｄ 测量菌落直径，计算菌落生长速率；于７ ｄ时用无菌水轻轻洗刷ＰＤＡ表面绿色孢子放入１００ ｍL盛有无菌水的三角瓶中，在２００ ｒ／ｍｉｎ的摇床上振荡２０ ｍｉｎ，然后用血球计数板测量孢子数。每处理重复３次，并以出发菌株作为对照。生长速率＝平均菌落直径／生长时间。

１．２．４ 抗百菌清木霉突变菌株的敏感性测定 用无菌打孔器将培养２ ｄ各木霉菌落边缘截取直径６ ｍｍ的菌饼，将菌饼移植到含百菌清的ＰＤＡ平板中央，一个培养皿接一个菌饼，每个浓度重复 ３次，共设１００、３００、６００、９００、１ ２００、１ ５００、１ ８００ ｍｇ／Ｌ 7个浓度，并设空白平板为对照，置于２５ ℃培养７ ｄ。每天用十字交叉法测量菌落直径，并按下式计算生长抑制率。抑制率 ＝［（对照菌落直径-处理菌落直径）／对照菌落直径］×１００％。

将各抑制率换算成抑制率概率值，以各处理中杀菌剂浓度对数值作自变量ｘ值，以相应处理对菌丝的抑制率概率值为依变量y值，用统计回归方法求出供试杀菌剂的毒力曲线方程y＝ａ＋ｂx，计算ＥＣ５０（抑制中浓度）［９］，并以ＥＣ５０作为比较各菌株抗百菌清毒力强弱的依据。

１．２．５ 抗药性木霉突变菌株的拮抗作用测定 采用对峙平板法，将抗药性木霉菌株分别与５种病原菌对峙接种在ＰＤＡ平板两端，两接种点距离中心２ ｃｍ，菌饼直径６ ｍｍ，以单独接种病原菌株作为对照。每个处理重复３次，置于２５ ℃恒温箱中培养，每天测量病原菌落中心指向木霉菌落半径的相向距离以及对照病原菌落半径，并计算其抑菌率。

抑菌率＝［（病原菌对照菌落半径-病原菌落中心指向木霉菌落半径的相向距离）／病原菌对照菌落半径］×１００％。

１．２．６ 抗药性木霉突变菌株后代遗传稳定性［１０］ 将上述试验所得的抗药性木霉突变菌株分别接种在ＰＤＡ平板上，在２５ ℃恒温培养箱中培养，每７ ｄ转接１次，连续转接１０次。每个处理重复３次。观察菌株每次转接后的生长特性，并在含７５％百菌清可湿性粉剂１ ０００ ｍｇ／Ｌ的ＰＤＡ上培养进行抗药性测定，计算百菌清对突变木霉菌的生长抑制率。

２ 结果与分析

２．１ 拮抗木霉Ｔ３２菌悬液过滤材料的选择

由试验结果可知（表1），使用脱脂棉和擦镜纸进行拮抗木霉Ｔ３２菌悬液过滤效果比微孔滤膜好（孔径０．４５ μｍ、规格１５０ ｍｍ），其中使用６～７层擦镜纸过滤木霉菌菌悬液速度快，滤液浓度高，孢子分散效果最好，且操作简便。

２．２ 抗百菌清木霉菌株的诱变改良

从试验中观察可知，随着紫外线照射时间的增加，木霉菌株Ｔ３２分生孢子存活数量明显减少，说明紫外线处理对其分生孢子具有很强的致死作用（图１）。当设置不同的紫外线照射时间，并结合含药培养基（７５％百菌清可湿性粉剂１００ ｍｇ／Ｌ）进行诱变后，再提高药剂浓度逐步进行驯化，产生了具有高度抗药（２ ０００ ｍｇ／Ｌ）的突变型木霉菌株４株， 分别标记为Ｔ３２－１－２０ｍ、Ｔ３２－３－２０ｍ、Ｔ３２－４－７ｍ、Ｔ３２－５－１０ｍ，菌株呈深绿色，菌落密实，生长速度快。

２．３ 抗药性木霉菌株生长速率及产孢能力测定

由表２可知，紫外线诱变及含药培养基反复驯化所得到的４株高抗药性木霉菌株的生长速率均比亲本菌株Ｔ３２快，且产孢量高，菌株Ｔ３２－４－７ｍ、Ｔ３２－５－１０ｍ生长速率相对较快，与亲本菌株Ｔ３２相比较，生长速率平均增加0．55～１．３7 ｍｍ／ｄ，产孢量平均增加1．02～３．２４×１０９个／ｍL。

２．４ 抗百菌清木霉菌株的敏感性测定

由表３可知，４株抗药性木霉突变菌株对百菌清的敏感性表现出显著差异，其中木霉菌株Ｔ３２－１－２０ ｍ对百菌清杀菌剂的敏感性较强，而木霉菌株Ｔ３２－５－１０ｍ对百菌清杀菌剂的敏感性最弱（抗药性最强）；亲本菌株Ｔ３２对百菌清杀菌剂的敏感性最强，其ＥＣ５０值为１ ５８５．１６ ｍｇ／Ｌ，而选育出的抗药性木霉菌株Ｔ３２－５－１０ｍ其ＥＣ５０值最高，达３１ ６２８．９７ ｍｇ／Ｌ，比亲本菌株的抗药性提高了２０倍，说明该木霉突变菌株对百菌清的抗药性大大增强；其他３株诱变木霉菌株与亲本菌株相比较，其抗药性也均有不同程度的提高。

２．５ 抗药性木霉菌株的拮抗作用测定

对峙培养观察结果表明，各木霉菌株先在各自一边的ＰＤＡ培养基上生长，随后很快与病原菌菌落边缘接触，并对其产生抑制作用，使病原菌生长速度减缓直至最后停止，菌落稀疏。当４８ ｈ时各抗药性木霉菌已部分包围病原菌；７２ ｈ时木霉菌丝通过重寄生等方式逐渐侵入病菌菌落，两者接触处形成明显抑菌带；７ ｄ时病原菌菌落明显衰退，出现较宽抑菌圈，而木霉菌落生长仍很旺盛。由表４可知，４株抗药性木霉菌株对３种病原菌的拮抗作用均较强，其抑菌率达到８１．２７％～８９．１１％，尤其抗药性木霉菌株Ｔ３２－４－７ｍ、Ｔ３２－５－１０ｍ表现出了显著的拮抗作用，其抑菌率均高于亲本木霉菌株Ｔ３２。

２．６ 抗药性木霉菌株后代遗传稳定性测定

由表５可知，紫外线诱导与含药培养基驯化所得到的４株木霉突变型菌株经连续１０次转接后，其后代遗传稳定性较强，其中Ｔ３２－５－１０ｍ、Ｔ３２－４－７ｍ生长抑制率变化不大，表明随着传代培养抗药性没有消失，尤其是菌株Ｔ３２－５－１０ｍ稳定性非常好。

３ 结果与讨论

１）本研究采用紫外线诱变与含药（百菌清）培养基驯化相结合的方法，选育出了４株高度抗药性木霉菌株，其中Ｔ３２－５－１０ｍ菌株与亲本木霉菌株Ｔ３２相比较，其抗药性提高了２０倍，生长速率和产孢量均高于亲本菌株，连续转接１０代，其抗药性非常稳定，且对供试３种土传病原真菌的抑制率达８７．５６%～８９．１１％。

２）紫外线作为一种物理诱变因子，具有诱变效果明显及方法简单等优点，是诱发微生物突变的一种非常有用的工具，通过扩大突变体的筛选基数，可筛选得到性能优良的突变菌株［1，１１，１2］。

３）本试验成功筛选出对百菌清杀菌剂产生高度抗性的木霉菌株Ｔ３２－５－１０ｍ，与亲本菌株Ｔ３２相比较，其他主要性能也并无消减，如生长速率、产孢能力以及拮抗作用均高于亲本菌株，这无疑提供了对环境适应能力更强的生防木霉菌株，使其制成的生物制剂在田间应用时不受或少受杀菌剂的影响，既提高了生防制剂的防治效果，同时也为实现生物农药与化学农药综合协同作用奠定了良好的基础。

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