猪支原间接血凝诊断抗原制备

摘要 通过对猪肺炎支原体的扩大繁殖，在培养基颜色变黄时收集菌液，通过浓缩、裂解、致敏、醛化鞣酸化绵羊红细胞而制备出猪肺炎支原体间接血凝诊断抗原，并应用微量间接血凝试验对所制备的抗原进行灵敏度和特异性检测。结果表明，所制备的猪肺炎支原体间接血凝诊断抗原灵敏度高、特异性强，可以为猪支原体肺炎的血清学诊断提供材料。

关键词 猪；肺炎支原体；间接血凝诊断；抗原制备；灵敏度

中图分类号 S852.5+2 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）05-0280-01

猪肺炎支原体间接血凝抗原是针对猪支原体肺炎（Mycoplasma pneumoniae of Swine，MPS）的特异性血清抗体检测用生物制品，是猪支原体肺炎血清学诊断的重要组成部分。本研究应用抗原制备技术，以猪肺炎支原体地方分离菌株作为种子，制备出针对猪肺炎支原体的抗原，并应用所制备的抗原进行微量间接血凝试验，为支原体的血清学诊断、疫苗生产质量监测乃至猪肺炎支原体污染细胞检测提供必要的条件。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验试剂。牛心浸液（自制）、猪胃消化液（自制）[1]、无支原体新生牛血清（杭州四季清生物工程材料有限公司生产）、健康绵羊（雄性）血液、健康家兔血液、酵母浸粉、牛肉浸膏、水解乳蛋白、葡萄糖、青霉素G、迭氮钠、硫柳汞、戊二醛、0.15 moL/L pH值为7.2的磷酸盐缓冲盐水（PBS液）、0.15 moL/L pH值为6.4的PBS液、1/20 000鞣酸PBS液、1%兔血清缓冲盐水、阿氏液等。

1.1.2 培养基。供试培养基为肺炎支原体肉汤培养基，按常规方法制备备用。

1.1.3 试验设备。组织捣碎机、恒温培养箱、低温冰箱、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、冷冻离心机、低速离心机、超声波破膜仪、水浴锅、微量振荡器、分析天平。

1.2 试验方法

1.2.1 抗原制备。①菌株扩大繁殖。按1%～10%接种量，将猪肺炎支原体菌液接种于300 mL肺炎支原体肉汤培养基中。培养基用40支中号试管分装，棉塞封口，分别标记为1～40号，置于37 ℃恒温培养箱中培养，每天观察培养基颜色变化，待颜色变黄（即pH值由7.6降至6.8）时收获。②浓缩。将收获的培养物以6 500 r/min低温（-4 ℃）离心60 min，除去上清液，沉淀的菌体用0.15 moL/L pH值7.2的PBS液离心洗涤2次，每次6 500 r/min离心10 min。最后一次离心沉淀的菌体，用含0.01%硫柳汞的PBS液配成原培养物体积1%的菌悬液。③裂解。将浓缩制得的菌悬液置于冰浴中经超声波间隙裂解15 min，吸取上清液作为抗原，置于-20 ℃冰箱中冻存，且不得超过6个月[2]。④绵羊红细胞戊二醛化。取保存在阿氏液中的公绵羊血液，以2 000 r/min离心15 min，沉淀用0.15 moL/L pH值7.2的PBS液反复离心洗涤3次，每次均为3 000 r/min离心3 min，除去上清液，取沉淀的红细胞，按每10 mL红细胞体积滴加1%戊二醛0.15 moL/L pH值7.2的PBS液100 mL，5 min内滴加完毕，于4 ℃冰箱中醛化50 min，中间振荡4～5次，取出后仍呈深红色，非常黏稠地沉积于离心管底，须强力才能搅拌起，再以上述PBS液洗涤3次，每次均以3 000 r/min离心3 min。最后一次去上清液，加入含0.01%硫柳汞的0.15 moL/L pH值7.2的PBS液，配成10%戊二醛红细胞悬液，置4 ℃冰箱中保存且不得超过6个月[2]，供抗原致敏和吸收被检血清用。⑤醛化红细胞鞣酸化。取制成的10%戊二醛化红细胞液10 mL，以0.15 moL/L pH值7.2的PBS液洗涤3次，每次均为3 000 r/min洗涤3 min，去上清，加入上述PBS液32.4 mL（去掉了1 mL的红细胞量），配成3%戊二醛化红细胞悬液，加等量体积（33.4 mL）现配的1∶20 000浓度的鞣酸PBS液，充分混匀后置于37 ℃水浴中鞣化20 min，用pH值7.2的PBS液洗涤3次，每次均为3 000 r/min洗涤3 min，最后一次去上清液，往沉淀物中加0.15 moL/L pH值6.4的PBS液33.4 mL配成3%红细胞悬液，即为3%鞣酸化红细胞。置2～8 ℃保存，在7 d之内供抗原致敏用。⑥抗原致敏醛化鞣酸化红细胞。取3%醛化鞣酸化红细胞10 mL加1%抗原10 mL，于37 ℃水浴箱中感作30 min，以3 000 r/min离心3 min，去上清，沉积物用含0.5%兔血清pH值7.2的PBS液洗涤2次，每次均为3 000 r/min离心3 min，去上清。往沉淀物中加入含1/10 000硫柳汞的兔血清pH值7.2的PBS成20 mL，即为1.5%的间接血凝诊断抗原[3]。

1.2.2 灵敏度检测。①血清的处理。取猪肺炎支原体阳性血清0.2 mL于无菌小管中，56 ℃水浴30 min灭活。冷却后加入2%戊二醛化红细胞悬液0.3 mL，摇匀，置37 ℃水浴30 min，离心后吸出血清供检验用。②试验对照用红细胞液的制备。取3%醛化鞣酸化红细胞液5 mL与0.15 moL/L pH值7.2的PBS液等量混合后，置37 ℃水浴箱中30 min，以3 000 r/min离心3 min，去上清，用含0.5%兔血清pH值7.2的PBS液将沉积物洗涤2次，每次均为3 000 r/min洗涤3 min，去上清。往沉积物中添加含1/10 000硫柳汞的1%兔血清pH值7.2的PBS配成10 mL，即为1.5%对照用红细胞。③检测方法。采用间接血凝试验方法进行。取洁净干燥的微量反

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应板，选取相邻的2排孔，用移液枪吸取1%正常兔血清0.15 moL/L pH值7.2的PBS液分别加入2排孔中，每孔加入25 mL。稀释血清，用移液枪吸取56 ℃灭活30 min的猪肺炎支原体阳性血清25 mL加于第1排第1孔中，反复吹打使其充分混匀后，吸取25 mL于第2孔同前混匀后吸至第3孔，如此反复直至倒数第2孔，最后一孔不加阳性血清作为对照。用移液枪吸取支原体抗原致敏的红细胞诊断液，加入第1排孔中，每孔25 mL，再吸取对照用醛化鞣酸化红细胞液加入第2排孔中，每孔25 mL。将血凝反应盘置于微量振荡器上，振荡3～5 min，充分混匀，取下反应盘，将其置于事先铺有纱布的搪瓷盘内，置37 ℃恒温培养箱中1.0～1.5 h后取出观察结果，必要时可放室温下过夜，次日观察反应结果，并作出最终判断。④结果判定。判定时，应首先看对照孔，只有在各个对照孔完全正确的情况下，说明反应条件正常，方可判定结果。

1.2.3 特异性检测。①血清的处理。取猪肺炎支原体阳性血清和猪鼻支原体阳性血清各0.2 mL于2支无菌小管中，56 ℃水浴30 min灭活。冷却后分别加入0.3 mL 2%戊二醛化红细胞悬液，摇匀，置37 ℃水浴30 min，离心后吸出血清供检验用。②试验方法同灵敏度检测方法。若所制备的猪肺炎支原体间接血凝诊断抗原与猪肺炎支原体阳性血清出现凝集现象，而不与猪鼻支原体阳性血清发生凝集，则可判定所制备的诊断抗原具有特异性。

2 结果与分析

2.1 抗原制备

菌株扩大繁殖，接种菌液后置于37 ℃恒温培养箱中培养，每天观察培养基颜色变化。第1～3天均未出现颜色变化。第4天观察有10支试管中培养基出现微黄色，分别是2、5、11、18、21、25、26、32、35、39号，剩下的30支试管中的培养基无明显变化。直至第7天时40支试管中培养基全部变为黄色，此时即可收获进行浓缩、裂解等。培养物经浓缩、裂解，获得浓缩抗原3 mL。绵羊红细胞经醛化鞣酸化处理后致敏抗原，最后获得1.5%的间接血凝诊断抗原20 mL。

2.2 灵敏度检测

所制备间接血凝诊断抗原，经间接凝集试验检测，与《国家生物制品制备和检验规程》结果相符，结果表明，其具有较高的灵敏度（表1）。

2.3 特异性检测

所制备间接血凝诊断抗原，经间接凝集试验检测，结果表明有较强的特异性（表2）。

3 结论与讨论

试验结果表明，猪肺炎支原体阳性血清稀释到1∶128时仍出现“++”凝集现象，说明该猪肺炎支原体间接血凝诊断抗原具有很高的灵敏度。同时特异性检测结果显示，制得的猪肺炎支原体间接血凝诊断抗原与猪肺炎支原体阳性血清发生凝集，而不与猪鼻支原体阳性血清发生凝集，说明该猪肺炎支原体间接血凝抗原特异性较强。微量抗原间接血凝试验可缩短猪肺炎支原体检测时间，避免猪肺炎支原体分离培养过程中成本较高、耗时较长等缺点。因此，猪肺炎支原体间接血凝抗原的制备在临床辅助诊断可显示出其快速、灵敏、特异性强的优越性[4]。

4 参考文献

[1] 陈天寿.微生物培养基的制造与应用[M].北京：中国农业出版社，1995：64，94-95，470-483，613.

[2] 农业部.猪支原体肺炎微量间接血凝试验抗原与阴、阳性血清制造及检验规程[S]//中华人民共和国兽用生物制品规程，2000.

[3] 王世若，王兴龙，韩文瑜.现代动物免疫学[M].2版.长春：吉林科学技术出版社，2001：452-462.

[4] 李春，王红宁.猪气喘病诊断防治的研究进展[C]//猪的重要传染病防治研究新成果.中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会，2002：256-259.

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