猪痢疾短螺旋体的检测及免疫原性初步分析

摘要：通过对猪痢疾短螺旋体的检测以及感染情况调查，从而进行免疫原性分析。对兴化市及其周边地区50个猪养殖场中发生猪痢疾的感染情况进行调查，并对猪痢疾的端螺旋体实施检测，进而培养并进行免疫原性分析。在调查的50个猪养殖场中发生感染的病猪占到了6.3%，通过免疫原性初步分析，可以通过免疫重组引起抗体的有效性提高。猪痢疾短螺旋体的检测、感染情况调查及免疫原性初步分析可以为猪痢疾的疫苗制作提供一个理论基础。

关键词：猪痢疾；短螺旋体的检测；感染情况调查；免疫原性初步分析

猪痢疾在临床上又叫做血痢，是一种感染生长育肥期猪的肠道传染病，而猪痢疾短螺旋体是一种细菌性病原，该病原体会引起猪的大量死亡，从而给养殖户带来巨大的经济损失，猪在感染短螺旋体病原体后在临床上主要表现为消瘦、脱水、粪便变红。近年来随着抗生素药物的使用，猪痢疾短螺旋体病原体逐渐的已经产生了抗药性，一些常规的抗生素已经逐渐的失去了作用，因此，加强猪痢疾短螺旋体的检测以及免疫原性分析显得至关重要。现主要对猪痢疾短螺旋体的检测、感染情况调查及免疫原性初步分析等相关资料予以回顾分析，就其中的主要内容报道如下。

1.材料及方法

1.1材料

对兴化市及其周边地区50个猪养殖场中发生猪痢疾的感染情况进行调查，并从兴化市动物疫病预防控制中心收集了腹泻样品38份、肠道样本60份，此外还从兴化市的养殖场采取了肠道样品280份。主要来源是母猪以及不同龄期的育肥猪的粪便，且这些样本采集对象均不同程度的表现出腹泻，此外还需要准备相关的试剂，主要有血液及DNA提取试剂盒以及粪便DNA提取试剂盒，另外还有厌氧袋、壮观霉素、革兰氏染色液等。需要用到的仪器包括高速冷冻离心机、生物安全柜、扫描电子显微镜、恒温水浴锅以及实时荧光定量PCR仪器。在免疫原性分析中需要用到的有PCR酶、限制性内切酶、T4连接酶。

1.2方法

猪痢疾短螺旋体感染情况调查主要采用实地调查的方法，对不同养殖场猪痢疾情况进行统计分析。

对于猪痢疾短螺旋体的检测主要有以下几个步骤：①粪便DNA的提取，取180mg左右的猪痢疾粪便，放置到2mL的离心管中，此后将该离心管放到冰上面，加入1.4mL的ASLbutter到每一个管中，摇匀之后放置在70°C条件下，时间为5min，此后进行振荡并离心，去除1个新的离心管吸取离心之后的悬浮液1.2mL，并向其中加入抑制剂，再次振荡，直到抑制片完全吸收，之后再次离心操作，离心结束后取出1.5mL的离心管放人上层悬浮液，再次离心，在离心过程中加入一些外加剂，直到提取出粪便内的病原体DNA；②肠黏膜组织的DNA提取，首先刮取25mg的肠黏膜放入1.5mL的离心管中，同时加入180uLATL的缓冲液，然后加入20gL蛋白酶K，在混合之后，保持56°C条件下对其孵育，在孵育过程中定期的摇动离心管，此后取出离心管涡旋15秒，加入200gL缓冲液摇匀，再加入200gL的无水乙醇，涡旋充分混合。提取裂解液加入到2mL的吸附柱中，离心之后放入一个新的收集管，此后再经过洗脱液最终，提取出肠黏膜组织的DNA；③阳性样本的分离培养，在上面的检测中将检测出来的阳性样本需要及时进行分离培养，接种之后，在培养基上分别加入壮观霉素、多黏菌素以及万古霉素，根据该病原体的生活条件，需要在厌氧条件下保持在37C，培养时间为5天左右，在培养完成后，使用显微镜对猪痢疾端螺旋体实施检测，并进行革兰氏染色，染色的步骤分别为龙胆紫、碘液、脱色液、沙黄，每一个步骤持续时间为10秒，扫描电子显微镜。

2.结果

2.1荧光定量PCR检测分析

对378份样本DNA进行荧光定量PCR检测，在检测结果中通过分析发现有35份阳性样本，在检出的阳性样本中，在临床表现腹泻的病猪感染率较大，而从动物防疫疾病预防和控制中心搜集的无腹泻样本中感染率比较低，此外在不同地区的病猪感染方面，没有表现出明显的差异。

2.2基因BlpA生物信息分析

根据BlpA的基因序列，使用DNAStar软件找出其中的ORF，经过分析，大小是816bp，由271个氨基酸组成，理论上分子量为29652.55Da，等电位是4.47，属于外源蛋白。将猪痢疾短螺旋体的DNA作为模版，在PCR电泳过程中出现了一目亮带，主要在816bp附近，这个和我们预期的设想是一致的。

3.讨论

猪痢疾是一种传染性比较强的疾病，在育肥期的猪中比较常见，同时发病率比较高，在对兴化市的50个养猪场开展调查之后，感染的病猪占到了6.3%，并且出现了部分病猪死亡的事件，所以猪痢疾属于养猪过程中一个重要的医学难题，并且会引起一系列的不良反应，首先猪的正常生长受到了限制，生长比较慢，提高了饲养过程中的成本，养猪场需要花费更多的人力和物力去管理病猪，同时猪痢疾具有传染性，会严重影响到其他健康猪的生长，可能会引起较多猪的感染，严重的引发病猪死亡，给养殖户带来巨大的经济损失，猪痢疾需要及时的诊断和治疗，才能尽可能的降低由此造成的经济损失。

在豬痢疾端螺旋体检测过程中对378份样本DNA进行荧光定量PCR检测，在检测结果中通过分析发现有35份阳性样本，而且280份样品是从腹泻的病猪采集的，其余的98是来自兴化市的动物疾病预防和控制中心，这些是没有腹泻的，在没有腹泻的检测中阳性样本3份，其余的32份均是来自腹泻的病猪，而且不同地区的猪痢疾发病率是有差异的，但是差异不明显。不同龄期的猪在猪痢疾发病方面也是有差异的，将前几年猪痢疾发病率的调查的猪痢疾病情发展比较，发现猪痢疾病情发展出现了下降趋势，这和学者的研究工作是分不开的。

猪痢疾属于一种常见病，可以预防治疗，具体的就是要做好每个环节的监测工作，并注意养猪场的环境问题，特别是在夏季时，一定要定期的进行杀菌消毒。

通过对猪痢疾短螺旋体免疫原性初步分析_5]，发现猪痢疾短螺旋体在长期的治疗过程中主要是依靠一些抗生素药物进行治疗，缺乏疫苗、各种抗生素的使用导致猪痢疾短螺旋体发生变异，逐渐的产生了抗药性。在后期的治疗过程中普通的一些抗生素药物已经失去了作用，及时有效地研制出猪痢疾短螺旋体的疫苗显得至关重要。

当前阶段，对于猪痢疾短螺旋体的疫苗研究主要还在毒力蛋白上，使用克隆的方法可以实现亚单位疫苗的制作，而且在制作过程中，需要的时间短，可以大规模的生产，并且制作成本低，值得临床上研究和制作。

猪痢疾短螺旋体的编码基因Blpa进行了扩增，并重新构建了重组质粒，构建成功后表达出了重组蛋白，并提取了相关样品，提取出来的样品对小鼠实施免疫，在免疫过程中监测血清中特异性抗体的含量变化，在第一次免疫结束后，根据检测结果，小鼠体内的血清特异性抗体有一个较高的水平，而且在一段时间内没有发生改变，通过这个实验证明了使用重组蛋白可以诱发高水平抗体的产生，有利于提高猪的免疫力，也为猪痢疾短螺旋体疫苗的研制工作提供了一个科学依据。

大规模的养猪场得到了快速发展，但是猪痢疾短螺旋体会严重影响到猪的正常生长以及养殖户的经济利益，所以做好猪痢疾短螺旋体感染的调查工作很重要，在此基础上进行免疫原性初步分析，进一步的掌握短螺旋体的免疫反应，从而确定最佳的药品做好预防和治疗工作。此外，猪的其他一些疾病有可能会被误诊为猪痢疾短螺旋体，需要明确猪痢疾短螺旋体的诊断标准，比如在检测过程中使用的荧光PCR检测技术，就具有重要的诊断价值。

总之，猪痢疾短螺旋体的检测具有重要意义，做好猪痢疾短螺旋体的预防和治疗工作需要选择合适的抗生素药物，同时还需要积极地研制疫苗，从而做好疫苗接种，避免猪痢疾短螺旋体感染的发生。

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