抗、感白粉病春小麦感染白粉菌后抗病特性的细胞学观察

摘 要：以白粉菌15号生理小种感染抗、感白粉病春小麦为对象，通过细胞学观察发现，白粉菌在抗病春小麦上发育畸形，有分瓣型和纤细型附着胞出现，并发现细胞质凝集和过敏性坏死等现象。研究结果为从细胞学角度分析小麦抗白粉特性提供了一种有用方法。

关键词：小麦白粉病；抗白粉病春小麦；白粉病敏感春小麦；抗性；白粉菌

中图分类号：S512 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.04.001

小麦白粉病（Powdery mildew）是由专性寄生真菌禾布氏白粉菌Blumeria graminis （DC）Speer f . sp. tritici Emend Marshal（Bgt）引起的一种真菌性病害，属世界性分布，严重影响了世界小麦的产量[1]。作为世界上第一大粮食作物，小麦在种植面积、产量、库存量及贸易额等方面居多种主要粮食作物之首，全世界大约有35%～40%的人口以小麦为主食[2]。我国小麦种植以冬小麦为主，占小麦总面积的84%，春小麦占16%，春小麦主要分布在长城以北，主产省有黑龙江、内蒙古、甘肃、新疆、宁夏等。白粉病是我国小麦产区最重要的病害之一，对小麦产量影响较大[3]。因此，深入地开展对小麦白粉病的防治研究，寻找有效的、稳定的抗源对小麦进行抗病育种有重大意义。近年来，一些研究者在不同小麦品种对白粉病的抗性鉴定方面做了大量工作[4-14]。但对春小麦白粉病抗性鉴定，春麦抗病的细胞、遗传及分子研究的工作还相对滞后。本研究对抗、感白粉病的2种春小麦进行了抗性鉴别， 从细胞学即2种春小麦在感染白粉病后的白粉菌生长状况进行了比较分析，为春小麦抗病机理研究提供基础性资料，以便为抗病春小麦的培育及推广提供依据。

1 材料和方法

1.1 供试小麦品种与病原菌

供试品种：对白粉病具抗性和敏感的两种春小麦品种由天津市农业科学院作物研究所王继忠先生提供，将上述两个品种的种子进行催芽后种入提前灭过菌的花盆中，置于25 ℃恒温环境中培养至第一片叶完全长出，待用。

白粉菌15号生理小种 （Blumeria graminis f.sp tritici） 由中国农业科学院植物保护研究所提供。

1.2 接种及白粉菌的抗性鉴定

1.2.1 接种 接种前轻轻抖动待传菌用的小麦叶片，抖掉叶片上的老孢子，以保证白粉菌的孢子在接种时新鲜一致。用毛笔蘸取白粉菌孢子后用相同的力度均匀刷在叶片背面。

1.2.2 试验设计 将两种参试品种，每个品种种5盆，每盆种15粒完全萌发的种子，以相同的间隔排开，待第一片叶完全长出后接种，放置于人工气候培养箱中培养（白天温度25 ℃，湿度60%，光照强度80 lx，16 h；夜间温度22 ℃，湿度60%，黑暗，8 h）。

1.2.3 调查方法 待叶片染菌两周后， 分别对两个小麦品种进行取样， 每盆取5个幼苗，每个幼苗取一片未枯死的叶，按病叶分级标准分级记录[15]。标准如下。

1级：病斑占叶面积的10%以下；2级：病斑占叶面积的10%～25%；3级：病斑占叶面积的26%～50%；4级：病斑占叶面积的51%～80%；5级：病斑占叶面积的80%以上。

1.3 供试品种接种白粉菌后的细胞学观察

植物材料接种后，分别于不同染菌时间点（4，8，12，24，48，72 h）取2 cm左右叶段4段，置于固定透明液（无水乙醇∶冰乙酸∶1，0.15%三氯乙酸）中固定72 h，再用染色液（0.6%考马斯亮蓝R-250甲醇溶液∶15%三氯乙酸=1∶1）染色24 h[10]，冲洗叶片表面的染色液后于保存液（冰乙酸∶甘油∶水=1∶4∶15）中保存待用。取叶段于载玻片上，用保存液作浮载液制成临时装片，于显微镜下观察附着胞形态及宿主抗性反应等互作位点情况。

2 结果与分析

2.1 白粉病抗性鉴定结果

对白粉病具抗性和敏感的两种春小麦在接种白粉菌两周后，对其进行苗期白粉病抗性鉴定。抗性春麦叶片上有极少数零星病斑、无坏死叶片；而感性春麦接种后发病快，叶片上有连成片的病斑，且有孢子堆。抗性鉴定结果如表1和表2，抗性品种白粉菌占叶片面积的6.99%，表现为白粉病高抗型，敏感品种白粉菌占叶片面积 97.06%，表现为白粉病高感型。

2.2 抗、感白粉病春小麦接种白粉菌后的细胞学观察

2.2.1 感病春小麦白粉菌发育情况 本试验在接种白粉菌后不同时间点取材，将材料固定透明后采用考马斯亮蓝R250染色24 h，在显微镜下记录白粉菌孢子在敏感品种上的发育情况。图l分别为接种后不同时间点敏感品种上白粉菌的发育形态。其中a为接种后4 h，分生孢子萌发出初生芽管；b为8 h，附着胞芽管；c为24 h，附着胞形成吸器；d为48～72 h，形成次级菌丝。

显微观察结果表明，白粉菌15号生理小种在感病品种上萌发较早，孢子在4 h就开始萌发。新产生的芽管不会立刻侵入寄主细胞，而是先在寄主表面生长扩展。在8～12 h，芽管末端逐渐膨大形成附着胞，随后在24 h附着胞中间产生一个细的侵染钉侵入寄主表皮细胞，并且随后产生吸器吸收营养，这意味着侵染成功。48～72 h开始产生次生菌丝。

2.2.2 抗病春小麦叶片上白粉菌附着胞畸形情况 成熟的附着胞一般呈镰刀状，但是也常会存在一些畸形的附着胞，尤其是在抗性材料上，这些畸形附着胞因为不能从植物细胞正常吸收营养，所以不能继续生长发育。常见的畸形形态包括：分瓣型附着胞（其顶端具有2～3个分瓣）、纤细型附着胞（芽管极度延伸变得纤细），分瓣型和纤细型附着胞均不能形成正常附着胞，不能吸收寄主营养。

本试验中，在抗性材料上观察到了白粉菌附着胞的畸形，如图2， 其中a是分瓣型附着胞畸形；b所示为芽管纤细型畸形；c为细胞质凝聚；d表示过敏性坏死。分析产生这一原因可能是由于免疫材料叶片细胞壁较厚，白粉菌不易附着并成功侵染，所以只能使芽管继续伸长寻找可附着的位点，这就产生了附着胞畸形。形成分瓣型附着胞和纤细型附着胞，如图2的a，b。而在抗性材料上由于有较强的防御反应，能够抑制白粉菌继续侵染，从而出现细胞质凝聚、过敏性坏死等防御反应。本试验中，在抗病材料上出现了这种防御反应。图2的c所示为抗病品种叶片上寄主对白粉菌侵染的细胞质凝聚反应，图中在互作位点处，寄主有明显的一片圆形细胞质凝聚，而该处白粉菌芽管伸长，末端附着胞细而小，未呈现正常的喙形，可能是由于寄主与白粉菌互作中，寄主细胞质凝聚，使得白粉菌无法有效入侵吸收营养，有效抑制了白粉菌附着胞的发育。图2的d是细胞过敏性坏死。其细胞壁发生沉积，细胞质凝聚，尤其是在侵染点周围，有较深的细胞质凝聚，整个细胞坏死后，病原菌不能从中吸取营养，从而抑制了病原菌的生长扩张。

3 讨论与结论

在本试验中，通过研究两种品种小麦与白粉菌的互作情况，发现白粉菌在两种材料上的发育形态是不同的，而且不同品种对白粉菌侵染的防御反应也是有相当大差别的。在感病材料上白粉菌更容易萌发，而且萌发时间较早。在接种白粉菌4 h后就发现白粉菌孢子开始萌发，随后产生附着胞等结构，白粉菌在寄主细胞萌发后24 h左右就可观察到白粉菌的侵入钉。叶片在白粉菌初侵染过程中也会呈现出对白粉菌的防御反应，也会有少量的细胞质凝聚现象，但是几乎没有观察到过敏性坏死现象。

在抗性材料叶片上，白粉菌萌发的稍晚，生长速度较敏感春小麦而言也会相对较迟缓，会表现出较为强烈的防御白粉菌反应。白粉菌因为细胞的过敏性坏死而不能从寄主细胞吸收营养，会耗尽自身的养料而最终死亡，因而阻止了白粉菌的侵染。抗病小麦叶片上也会出现白粉菌畸形，会出现纤细型芽管。防御反应中会有较多的细胞质凝聚，分瓣型附着胞。最后还会观察到防御反应，如过敏性坏死、细胞质凝聚。分瓣型附着胞说明寄主细胞对白粉菌侵染呈现多层次、多阶段的防御反应特点。本研究对两种春小麦抗白粉病特性作了鉴别，同时从细胞学角度对白粉菌的发育特性作了比较分析，所得结果对于春小麦的生产及抗病育种有参考价值。

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