鱼类水霉病植物源性杀菌剂的筛选

摘 要：为探究鱼类水霉病植物源性杀菌剂的抑菌效果，以水霉病菌为供试病菌，选取了多种具有消炎、杀菌功效的药用植物进行抑菌活性筛选，以抑菌圈直径大小为指标，确定植物提取物对水霉菌的抑菌效果；筛选抑菌效果较强的植物提取物，测定其对水霉菌的最低抑菌浓度（MIC）、最低杀菌浓度（MBC），以及其对水霉菌生长抑制率、菌丝生长量的影响。结果表明：黄连、油茶饼、大黄等植物提取液对水霉菌的生长具有较强抑制效果；三者对水霉菌的MIC值均较低，分别为3.125、6.25、12.5 mg/mL，對水霉菌的MBC值相差不大，均在为50 mg/mL左右。总体上，黄连表现出了相对最优的抑菌效果，当黄连提取液处理浓度达到500 mg/L时，抑菌率达到97%以上，菌丝鲜重低于0.02 g，抑菌效果最佳。

关键词：水霉病；鱼类；植物源性提取物；抑菌

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1006-060X（2018）09-0084-05

Screening of Botanical Fungicides for Fish Water Mildew

QI Jian-bo1，HE Xiao-e2，HU Qian2，GUO Yang1，SHI Hao1，2

（1. College of Horticulture and Landscape， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， PRC； 2. College of Agriculture

and Forestry， Hunan Applied Technology University， Changde 415000， PRC）

Abstract： To explore t the antibacterial effect of plant extracts against Botryosphaeria dothidea， and to provide direction for the development and use of safe and effective drugs for the treatment. In this paper， Botryosphaeria dothidea was used as test pathogens. A variety of plants with anti-inflammatory and bactericidal were selected for antibacterial activity screening. The growth rate and growth of mycelia were used as indicators to determine the antibacterial effect of plant extracts on Botryosphaeria dothidea. Then， the plant extracts with effective antibacterial effect were selected to determine the minimum inhibitory concentration （MIC）， the minimum bactericidal concentration （MBC）， and the growth inhibition rate and mycelial growth of Botryosphaeria dothidea. The experimental results showed that the extracts of Coptis chinensis， Camellia and Rheum palmatum have effective inhibitory effects on the growth of Botryosphaeria dothidea. The MIC values of the three extracts were 3.125 mg/mL， 6.25 mg/mL and 12.5 mg/mL， there was no significant difference in the MBC values， and they were all around 50 mg/mL. In general， Coptis chinensis showed the best antibacterial effect， when the concentration of Coptis chinensis extract reached 500 mg/L， the antibacterial rate reached more than 97%， and the fresh weight of hyphae was less than 0.02 g.

Key words： saprolegniasis； fish； plant extract； antibacterial

水霉病（Saprolegniasis），又叫肤霉病（Derma-tomyeosis）或白毛病，是淡水水生动物较常见的疾病之一，该病是由于水霉菌寄生在鱼体表面引起的一种高致病性真菌性疾病[1]。如果菌丝附着在鱼鳞上，经常导致鳞片脱落[2]。当受伤较深时，水霉菌可向内深入肌肉，蔓延到组织细胞间隙，向外长成的菌丝，呈灰白色的棉毛状，故称“白毛病”，在高密度的成鱼饲养过程中常发生此病[3]。过去使用安全性较低的孔雀石绿作为该疾病的首选药物，但孔雀石绿具有高毒性、致癌、致畸和致突变的副作用，我国于2000年将其列为禁用药物[4]。因此，迫切需要寻找一种更加安全有效的药物来控制该疾病。

相比较于化学合成药物，中草药是一种理想的天然绿色药物，具有来源广、成本低、药效长、使用方法简单等优点[5]。其机理是阻断或破坏真菌结构及大分子的生物合成、干扰真菌的能量代谢、通过改善和提高生物体免疫功能和对其他抗真菌药物的增效作用来杀灭或抑制真菌[6]。此外，还具有副作用少、毒性低、不易产生抗药性等特点[7]，加之其本身含有一定营养物质，如粗蛋白、粗脂肪、维生素等，可以提高饲料转化率，近年来被广泛用于防治各类水生经济动物病害[8]。研究表明，五倍子或菖蒲能有效地防治魚类水霉病的发生[9]。李川等[10]用中草药对患水霉病大鲵（Andrias davidianus）进行治疗，结果显示大黄和五倍子2种药液均对水霉菌有较好的抑制作用。笔者通过选择多种植物源性杀菌剂，以水霉病菌为供试病菌，采用牛津杯法对植物提取物的抑菌效果进行了研究，以期为鱼类水霉病的绿色防治探索出新途径，为解决鱼类水霉病无公害药物的研制与开发提供方向，达到提高水产养殖行业的经济效益、减少养殖户经济损失的目的，同时提高水产品的食品安全，提升人民健康水平。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试材料与试剂 供试植物共有64种，购于湖南九芝堂医药有限公司和湖南养天和大药房，部分常见植物自行采摘。药材经湖南农业大学药用植物资源工程专业肖深根教授鉴定。药材名称及药用部位列于表1。供试菌种为水霉菌（Botryosphaeria dothidea），由湖南文理学院生命科学院罗玉双教授提供。葡萄糖、琼脂粉、丙酮（中国医药集团上海化学试剂公司）试剂为分析纯。

1.1.2 仪器与设备 HVA-85全自动高压蒸汽灭菌锅（上海天呈医流科技股份有限公司）；DHG-9146A电热恒温鼓风干燥箱（无锡建仪实验器材有限公司）；DH5000B电热恒温培养箱（西安禾普生物科技有限公司）；FA2004电子分析天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；pH计（METTLER TOLEDO公司）；TGCXZ-5B超声循环提取机（北京弘祥隆公司）；FW100万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；Buchi R3旋转蒸发仪（瑞士Buchi公司）；LX-600P冷却水循环机（北京长流科学仪器公司）；DSZ2000X倒置生物显微镜（北京中显恒业仪器仪表有限公司）；SR-A10N-50冷冻干燥机（上海舍岩仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 植物源性提取液的制备 （1）植物药材打粉处理。采摘原植物经自然风干后放入50℃烘箱，烘干至恒重，用粉碎机粉后碎过100目筛。（2）提取液制备。分别称取各植物样品粉末10 g于100 mL三角瓶中，加丙酮50 mL用保鲜膜封口，18℃ 150 r/min恒温振荡提取12 h后，将三角瓶放入超声仪中，再经超声波提取30 min，然后将提取液抽滤，滤液浓缩至10 mL以内，倒入10 mL容量瓶中定容。配成活性物质提取物，质量浓度1.0 g/mL，对提取物母液进行编号，置于4℃冰箱中，保存备用。另将黄连、油茶、大黄提取物减压浓缩后冷冻干燥。

1.2.2 菌液的制备 菌种活化后接种于PDA培养基，18℃培养72 h，取直径约为4 cm的菌落于5 mL离心管中，用加2%吐温80的无菌0.9%生理盐水冲洗，再用玻璃珠打散，震荡、离心、过滤菌丝。采用血球板计数法确定菌悬液浓度[11]，浓度控制在105～106 CFU/mL之间，备用。

1.2.3 PDA培养基的配制 将马铃薯洗净去皮，称取200 g，切成2 cm大小于1 L的烧杯中，加入蒸馏水300 mL左右，在电炉上煮沸30 min。抽滤得滤液，滤液到入烧杯中，相继添加琼脂15 g、葡萄糖16 g，加蒸馏水补至1 L，搅拌，放入微波炉中待其充分融化，自然pH值，分装于250 mL锥形瓶中，加膜、包扎，121℃灭菌20 min，取出冷却至40℃左右，铺板或4℃冰箱保存。

1.2.4 提取液抑菌活性的测定 （1）抑制效果的测定。采用牛津杯法测定提取液对水霉菌的抑制率[12]。将PDA培养基倒入10 mL培养皿中至0.5 cm深度，凝固后，加入浓度为105～106个孢子/mL的菌悬液0.5 mL，用灭菌的小毛刷充分涂匀。取灭菌的牛津杯插入培养基中0.2 cm深度，每个培养皿等距离放置4个，再往各牛津杯中加入200 μL各植物提取液（采用0.22 μm的有机膜滤掉杂菌），用封口膜封口，置于18℃培养箱中培养，每个植物样本做4个重复，以丙酮试剂为阴性对照，以80 μg/mL纳他霉素为阳性对照。培养72 h后用游标卡尺、十字交叉法测定抑菌圈直

径[13]。其中：菌落净生长距离（cm）=菌落生长距离-菌饼直径。（2）最低抑菌浓度（MIC）值的测定。取12孔板编号倒入底层培养基待凝固后，将植物提取液混入40℃培养基中，最终浓度为1、10、20、30、50、100、200、300、400、500、700、1 000 mg/mL，倒入培养基上，待凝固后铺上浓度为105～106个孢子/mL的菌悬液0.3 mL，用灭菌的小毛刷充分涂匀。置于18℃的培养箱中培养，观察菌体生长情况，记录数据。（3）最低杀菌浓度（MBC）值的测定。将大于最低抑菌浓度的各提取液对倍提高浓度，混入40℃培养基中，并分别倒在底层培养基上，待凝固后铺上菌悬液，用灭菌的小毛刷充分涂匀。置于18℃的培养箱中培养，观察菌体生长情况，记录数据。确定无菌生长的最底提取液浓度。

1.2.5 提取物对菌生长抑制率的测定 提取物分别按质量浓度0（CK）、10、50、100、300、500 mg/L制成PDA平板，在超净工作台上，将直径0.9 cm的供试病菌菌饼块置于含药剂的培养基平板中央，每皿1块，每处理3次重复，置于18℃培养箱中培养4 d。按公式（1）计算菌丝生长抑制率[14]。

菌丝生长抑制率（%）=（对照菌落净生长距离-处理菌落净生长距离）/对照菌落净生长距离×100 （1）

1.2.6 菌丝生长量的测定 对水霉菌丝生长量抑制作用的测定在液体培养基中进行。于三角瓶中加入培养基后高压灭菌；将活化好的水霉菌用无菌生理盐水清洗，过滤掉菌丝，制得孢子悬浮液（106 CFU）。培养基冷却后在无菌条件下用移液枪加入孢子悬浮液1 mL，18℃振荡培养，待菌丝球生长良好时加入提取物，对照不加。继续培养2～3 d，待菌丝球长到直径为0.5～1.0 cm。过滤得菌丝体，用蒸馏水反复冲洗菌丝，将培养基去除干净，精确称取菌丝体的鲜量。每个处理重复5次，试验重复2次。

2 结果与分析

2.1 不同植物提取液的抑菌活性

2.1.1 各植物提取液对菌体的抑制效果 由表2可知，24种植物提取液对水霉菌显示出不同程度的抑菌效果，其中以黄连、油茶饼、大黄、苦参、五倍子、丁香、凤尾蕨等的提取液抑制作用较为明显，抑菌圈直径均在20 mm以上。黄连提取物的抑菌效果最明显，抑制直径达36.1 mm，其原植物体内可能有某种生物碱对水霉菌抑制效果较好[15]。同理推测大黄中可能含有某种蒽醌[16]、油茶中含某种皂甙对水霉菌也有较好的抑制效果[17]，今后可提取分离各组分作进一步分析。还有可能是丙酮的极性与这3种药材的有效成分极性相似，更易溶，故提取效果更好一些[18]。

2.1.2 各植物提取液对菌体的MIC和MBC 由表3可知，黄连、油茶饼、大黄对水霉菌的MIC值较低，分别为3.125、6.25、12.5 mg/mL，对水霉菌的MBC值均为50 mg/mL。可见，黄连、油茶饼和大黄的对水霉菌抑制效果突出。其中，黄连的MIC最低，说明其对水霉菌抑制效果最好，与十字交叉法测定抑菌圈直径试验结果相同。且该试验抑菌效果和十字法测定的抑菌圈直径结果基本一致，2个试验互相印证了几种植物提取液对水霉菌的抑制作用。

2.2 不同浓度植物提取物对水霉菌生长的抑制率

2.2.1 油茶饼提取物 由图1可知，油茶饼提取物对水霉菌菌丝生长具有抑制作用。随着提取物浓度增强，对水霉菌菌丝生长的抑制率逐渐增强，但是有其一定的范围；当油茶饼提取物浓度由300 mg/L增至500 mg/L时，抑制率由95%增至97%，增长效果不明显。因此，油茶饼提取物浓度在300～500 mg/L时抑菌效果最佳。

2.2.2 黄连提取物 由图2可知，黄连提取物对水霉菌菌丝生长具有抑制作用。随着提取物浓度增强，对水霉菌菌丝生长的抑制率逐渐增强，但是有其一定的范围；当提取物浓度由300 mg/L增至500 mg/L时，抑菌率由97%增至99%，增长效果不明显。因此，考虑到应用成本，黄连提取物浓度在300～500 mg/L时抑菌效果最佳。

2.2.3 大黄提取物 由图3可知，大黄提取物对水霉菌菌丝生长具有抑制作用。随着提取物浓度增强，对水霉菌菌丝生长的抑制率逐渐增强，但是有其一定的范围；当大黄提取物浓度由300 mg/L增至500 mg/L时，抑菌率由87%增至90%，增长效果不明显。因此，大黄提取物浓度在300～500 mg/L时抑菌效果最佳。但与油茶饼和黄连相比，对水霉菌的抑制效果稍弱。

2.3 不同浓度植物提取物对水霉菌生长量的影响

2.3.1 油茶饼提取物 由图4可知，当油茶饼提取物浓度为0、100、500、1 000 mg/L时，菌丝鲜重分别为0.121、0.063、0.008、0.005 g，再提高植物源提取物浓度，抑菌效果增强不明显。这说明当油茶饼提取物浓度在0～500 mg/L时，对水霉菌菌丝生长量减少作用变化最明显。

2.3.2 黄连提取物 由图5可知，当黄连提取物浓度为0、100、500、1 000 mg/L时，菌丝鲜重分别为0.121、0.072、0.014、0.006 g，再提高植物源提取物浓度，抑菌效果增强不明显。这说明当黄连提取物浓度在0～500 mg/L时，对水霉菌菌丝生长量减少作用变化最明显。当油茶饼和黄连提取物浓度处于同一水平时（1 000 mg/L），油茶饼提取物的抑制效果略强于黄连，与上述试验结果稍有差异，推测可能是达到了一定极限范围时，油茶饼提取物的抑菌效果与黄连提取物抑菌效果相差不大。

2.3.3 大黄提取物 由图6可知，当大黄提取物浓度是0、100、500、1 000 mg/L时菌丝鲜重为0.121、0.092、0.042、0.032 g，说明当大黄提取物浓度在100～500 mg/L时，对水霉菌菌丝生长量减少作用变化最明显。在提取物浓度为500和1 000 mg/L时，大黄提取物抑菌效果相差不大，且弱于黄连和油茶饼的抑菌效果。

3 结论与讨论

在广泛查阅文献的基础上，选取了64种具有抑菌活性的中草药植物，测定其对水霉菌的离体抑制效果。结果表明，有23种植物提取液对水霉菌表现出不同程度的抑制效果，其中以黄连、油茶饼、大黄、苦参、五倍子、丁香、凤尾蕨等植物的提取液对水霉菌效果较好，抑菌圈直径均达20 mm以上。尤其是黄连、油茶饼和大黄的抑菌效果突出，其提取物的MIC分别为3.125、6.25、12.5 mg/mL，对水霉菌的MBC均为50 mg/mL。同时发现随着植物源提取物浓度增强，对水霉菌菌丝生长的抑制率逐渐增强，但是当抑制范围达到一定程度时，即使再提高植物源提取物浓度，抑菌效果增强不明显，油茶饼、黄连、大黄提取物浓度都在300～500 mg/L时抑菌率增效不明显；即提取物浓度在0～500 mg/L时，对水霉菌菌絲生长的抑制作用最强。黄连提取液浓度达到500 mg/L时，抑菌效果最佳，几乎可对水霉菌进行完全抑制，在未来鱼类养殖生产中应用于鱼类水霉菌的绿色防控。

目前对植物源提取物的抑菌试验还处在室内细菌培养阶段，后期可研发鱼类水霉病植物源性杀菌剂进行室外防治研究，并且分析其具体成分和作用机理，为今后相关安全有效药物的开发与使用提供一定理论依据。

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（责任编辑：夏亚男）

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