人胰液双向凝胶电泳分离技术的建立和优化

摘要：目的建立并优化人胰液蛋白质组的双向凝胶电泳分离方法。方法通过比较几种常用的体液处理方法，确定了一种适于人胰液的蛋白质样品处理方法。经过一维等电聚焦和二维SDS -PAGE电泳后，有效分离了人胰液蛋白质组。 结果通过优化胰液蛋白质提取、上样量和固相IPG胶条分离范围的选择等步骤，建立了人胰液双向凝胶电泳的方法，并获得了分辨率较高、重复性较好的双向凝胶电泳图谱。 结论丙酮沉淀与双向凝胶电泳技术的结合是研究人胰液蛋白质组的一种有效的方法。胰液双向凝胶电泳方法的优化可为今后开展疾病相关的胰液蛋白质组学研究提供技术基础。

关键词：蛋白质组学；人胰液；双向凝胶电泳

中图分类号：O655.4文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)04-0005-05

Establishment and Optimization of Separation of Human Pancreatic Juice by Two-Dimensional Gel Electrophoresis

LIU Xiao-yong, HAN Jin-xiang, CUI Ya-zhou, ZONG Mei-juan, CHEN Yu, TIAN Mei

（Shandong Medical Biotechnological Center, Key Laboratory for Biotech-Drugs, Ministry of Health, Jinan 250062, China）

Abstract：Objective To establish and optimize the two-dimensional gel electrophoresis separation of proteome in human pancreatic juice.Methods By comparing several commonly used protein extraction methods，a method for the separation of proteome in human pancreatic juice was determined. The proteome in human pancreatic juice was effectively concentrated and separated by isoelectric focusing on first dimension and SDS-PAGE on second dimension.Results By optimizing the extraction of proteins in human pancreatic juice, loading amount and separation scope of IPG strip, the proteins were successfully extracted from human pancreatic juice and were separated by two-dimensional gel electrophoresis with higher resolution and better reproducibility.ConclusionAcetone-precipitation combined with two-dimensional gel electrophoresis is a suitable approach to study the proteome in human pancreatic juice. The optimization of the separation of human pancreatic juice by two-dimensional gel electrophoresis lays a technological foundation for the further investigation of disease-related human pancreatic juice proteomics.

Key words：proteomics; human pancreatic juice; two-dimensional gel electrophoresis

胰液中含有胰腺组织细胞所释放的高浓度的蛋白质与DNA。胰液中蛋白质的变化与胰腺的生理或病理状态密切相关，这些蛋白质是潜在的胰腺疾病标记物。因此，胰液的检测对早期胰腺疾病的筛查具有重要意义。目前国际上对胰液蛋白组分的研究多采用表面增强激光解析飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）技术[1]和一维液相分离与质谱鉴定联用（1DLC-MS/MS）的方法[2]，发现了HIP/PAP-I、PAP-2等具有重要的临床应用价值的胰腺肿瘤检测标志物。然而这两种方法的定量偏差和分辨率不高的缺陷却成为深入研究胰液蛋白质组学的技术瓶颈。

双向凝胶电泳技术依据蛋白质等电点进行第一向等电聚焦，然后根据蛋白质相对分子质量大小进行第二向SDS-PAGE分离，可以在一个平面上分离出数以千计的蛋白质，在整体水平上研究生命活动的规律，从中筛选出潜在的生物标记物，为寻找胰腺疾病早期诊断、治疗、预后的特异性标志物提供新的途径。但是胰液样品中富含的盐、脂和蛋白酶等物质，对双向凝胶电泳干扰较大。因此，如何提高胰液双向凝胶电泳的分辨率和重复性成为胰液蛋白质组研究的首要问题。

本研究通过对胰液样品双向凝胶电泳的几个关键环节的分析，建立了一种适合于有效分离胰液蛋白质的双向凝胶电泳技术方案，得到了分辨率较高和重复性较好的电泳图谱。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1标本胰液标本由山东大学齐鲁医院通过术后引流的方法提供。

1.1.2主要试剂考马斯亮蓝R350，IPG buffer（immobilized pH gradient buffer），Immobilized DryStrip，矿物油，2D-Quant试剂盒，2D-Cleanup试剂盒（GE Amersham公司）；尿素，硫脲，CHAPS，二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT），三羟甲基氨基甲烷（Tris-base），碘乙酰胺（IAA），甘氨酸，丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，四甲基二乙胺（TEMED），过硫酸铵，硝酸银，十二烷基磺酸钠（SDS），甘油，琼脂糖等（Ameresco公司）；其余为国产分析纯试剂。

1.1.3主要仪器与软件ALC-210精密天平（Sartorius公司）；超声粉碎仪GY98-3d（宁波新芝研究所）；Microfuge 22R高速低温离心机（Beckman公司）；Vmax酶标仪（Molecular Device公司）；Ettan IPGphor II等电聚焦仪、Ettan DALTtwelve垂直电泳仪和ImageMaster5.0凝胶图像分析软件（GE Amersham公司）；PowerLook2100XL扫描仪（Umax公司）；4700型质谱仪（ABI公司）；SZ-93纯水蒸馏装置（上海雅荣公司）；超低温冰箱（SANYO公司）；QL-901 Vortex和TS-1脱色摇床（其林贝尔公司）等。

1.2样品处理

新鲜胰液标本10 000×g，4 ℃离心20 min，收集上清分装－80℃保存备用。将标本分别按如下方法处理：

① 2D-Cleanup试剂盒处理胰液标本，操作参照试剂盒说明书。用裂解液（7 mol/L 尿素，2 mol/L 硫脲，4 % CHAPS，65 mmol/L DTT，2 % IPG Buffer）溶解沉淀过夜。

② 在胰液标本中加入4倍体积的预冷丙酮[含1 mmol/L 苯甲基磺酰氟（PMSF）]，－20℃沉淀2 h后，4 ℃，10 000×g离心10 min。用预冷的丙酮洗涤沉淀，室温干燥后，用裂解液溶解沉淀过夜[2]。

③ 在胰液标本中加入4倍体积的预冷三氯乙酸（TCA）/丙酮混合液（含20 %TCA，80 %丙酮，1 mmol/L PMSF），－20℃沉淀2 h后，4℃，10 000×g离心10 min。用预冷的丙酮洗涤沉淀，室温干燥后，用裂解液溶解沉淀过夜。

使用2D-Quant试剂盒将以上3种方法处理的样品和未经处理的胰液标本蛋白质定量。

1.3第一向等电聚焦电泳与平衡

将样品与水化液（8 mol/L Urea，2 % CHAPS，18 mmol/L DTT，0.5 % IPG Buffer，痕量溴酚蓝）混合，分组使用18 cm和24 cm IPG胶条（pH 3~10 NL）在IPGphor II水平电泳仪进行等电聚焦电泳。总聚焦数分别为50 kVh和65 kVh。

等电聚焦电泳后，将胶条从电泳槽中取出，用润湿的滤纸吸掉胶条上多余的矿物油，分别在平衡液基础液［1.5 mol/L Tris-HCl （pH 8.8），6 mol/L 尿素，87 %（体积分数）甘油69 mL/200 mL，2 %（质量浓度）SDS］中加入1 % DTT，和2.5 % IAA 2次平衡各12 min。

1.4第二向SDS-PAGE电泳

将平衡好的胶条放置于12. 5 %均匀SDS-PAGE分离胶上端，用0.5 %琼脂糖封固。电泳参数设置：初始功率每胶0.2 W，电泳1 h，然后使用每胶0.4 W，电泳1 h，再以每胶17 W电泳大约6 h，待溴酚蓝前沿迁移至SDS-PAGE胶下缘时停止电泳。

1.5染色

使用考马斯亮蓝R350染色法（方法参见说明书）对凝胶染色。

1.6图像采集与分析

PowerLook2100XL扫描凝胶，并使用Image Master 5.0软件分析图像。

1.7酶解与质谱鉴定

将切取的蛋白质点酶解后，进行质谱鉴定[3]。

2实验结果

2.1胰液蛋白几种提取法的电泳结果

我们分别使用丙酮沉淀法、TCA/丙酮沉淀法和2D-Cleanup试剂盒3种方法对胰液样品进行了处理。将提取的蛋白质定量后，我们按100μg的蛋白质量在18 cm干胶条（pH 3~10 NL）上双向凝胶电泳（图1）。

A. 未经处理的胰液原液双向凝胶电泳图谱（点数271）；B. 丙酮沉淀法处理的胰液双向凝胶电泳图谱（点数318）；C. TCA/丙酮沉淀法处理的胰液双向凝胶电泳图谱（点数274）；D. 2D-Cleanup试剂盒法处理的胰液双向凝胶电泳图谱（点数294）。

2.2等电聚焦电泳不同上样量的电泳结果

蛋白质的上样量会直接影响双向凝胶电泳图谱的分辨率。图2是丙酮沉淀法处理的胰液样品在不同上样量情况下的双向凝胶电泳图谱。

A. 胰液蛋白质500μg上样量双向凝胶电泳图谱（点数629）；B. 胰液蛋白质100μg上样量双向凝胶电泳图谱（点数318）。

2.3等电聚焦电泳IPG胶条不同长度的电泳结果

在IPG胶条长度的选择上，我们按500 μg蛋白质上样量分别选取了2种长度的IPG胶条，进行了双向凝胶电泳（图3），图3A是18 cm pH3~10 NL的胶条（点数629），图3B是24 cm pH3~10 NL的胶条（点数634）。

此外，诸如等电聚焦的电压设置、平衡时间的选择、SDS-PAGE电泳的电流设置，染色方法的选择等一些其他实验条件和方法，都是我们经过反复比较、优化调整而得出的。

2.4 部分蛋白质鉴定结果

我们对电泳凝胶的蛋白质点酶解后，进行了质谱鉴定，发现了一些新的胰液相关蛋白质。见表1。

3 讨论

由于胰腺位置隐蔽，多数胰腺疾病临床症状不典型，同时又缺少敏感和特异性的诊断指标，导致胰腺疾病严重威胁人类的健康和生命[3]。因此，发现新的敏感的、特异性强的胰腺疾病标记物进行早期筛查，成为当前胰腺疾病研究的主要方向。

胰液中含有很多胰腺分泌的关键调节蛋白质，在许多生理或病理状态下，这些蛋白质会在胰液中出现质或量的变化。与其他的胰液蛋白质分离方法相比较，双向凝胶电泳具有分辨率高、定量相对准确等优势。然而胰液样品中的盐、脂和蛋白酶等对双向凝胶电泳干扰较大，影响电泳图谱的重复性。因此，探寻一种能够有效增加胰液中蛋白质的抽提及其溶解性的方法，是建立胰液蛋白质表达谱所要解决的首要问题。

本文通过对胰液样品双向凝胶电泳的几个关键环节的分析，建立起一种适合于有效分离胰液蛋白质的双向凝胶电泳技术方案，并对胰液中的部分蛋白质进行了鉴定，得到了一些尚未报道的胰液相关蛋白质。

3.1丙酮沉淀法提取胰液蛋白质

蛋白质沉淀的方法可以去除脂、盐和核酸等杂质对等电聚焦电泳的干扰，还可以抑制蛋白酶活性，减少蛋白质降解并在一定程度上富集低浓度蛋白质，因此被广泛用于蛋白质样品的预处理和纯化。常用的沉淀剂为丙酮和TCA。由于我们在使用TCA处理其他样品时有蛋白质丢失现象，因此我们将TCA和丙酮按1:4的比例混合作为另一种沉淀剂。

结果发现，经沉淀法处理的样品图谱与胰液原液的电泳图谱相比较虽然有少量蛋白点的丢失，但是处理后的胰液电泳图谱在重复性和分辨率上要优于胰液原液图谱，并且出现了一些新的蛋白点，这些点是一些被脂类结合的蛋白质，以及一些容易被蛋白酶降解的蛋白质，通过沉淀过程的处理后保留了下来，从而显示在凝胶图谱上。我们认为，沉淀法处理后的样品，能够改善电泳的条件，图谱上多出了很多有望成为胰液生物标志物的蛋白点，更提高了图谱部分区域的分辨率，因此沉淀法可以作为胰液蛋白质组双向凝胶电泳样品制备的有效方法。

3种沉淀方法中，TCA/丙酮沉淀法与其他2种方法相比，有利于提高酸性蛋白质的分辨率，但造成了很多蛋白点的丢失，因此不适合胰液标本的处理。而实际应用中，与2D-Cleanup试剂盒处理法相比，丙酮沉淀法具有成本低廉、操作简便等优势。因此，我们认为利用丙酮沉淀法纯化胰液类盐、脂较丰富的样品，去除干扰成分，具有较好的效果。

3.2胰液蛋白质制备中蛋白酶的添加及重溶时间的选择

Wandschneider等[4,6]认为胰液中含有大量的蛋白酶，将未经处理的胰液样品直接进行双向凝胶电泳时应当使用多种多量的蛋白酶抑制剂如苯甲磺酰氟、抑酞酶等，防止胰液中蛋白质的降解，从而提高2-DE 操作的重复性。但是考虑到蛋白酶抑制剂本身对蛋白质的修饰可能并且可以出现在最后的双向凝胶电泳图谱中[4,5]，我们根据尽可能简化的原则仅加入PMSF，再与使用Cocktail复合蛋白酶抑制剂（Roche公司产品）的双向凝胶电泳图谱对比之后，证实完全可行，这也是建立使用丙酮沉淀法处理胰液和全程在冰上或－20℃的环境中操作，沉淀后的蛋白酶活性丧失的基础上的。

文献报道[3-5]的丙酮沉淀法中，沉淀的重溶时间有多种选择。我们分别对4 h与过夜2种情况作了预试验。结果显示，4 ℃沉淀重溶过夜并不会增加蛋白酶对蛋白质的降解，且蛋白质的溶解性还得到了显著提高。

3.3等电聚焦电泳上样量的优化

蛋白质的上样量会直接影响双向凝胶电泳图谱的分辨率。对于18 cm的胶条，图2 A加样量略显大（500μg，点数629），高丰度蛋白连成一片，低丰度蛋白分辨率低，严重影响了图谱的后续分析。图2 B加样量又略显小（100μg，点数318），虽然图谱效果明显好于图2 A，多数蛋白点清晰可辨，但部分低丰度蛋白却没有显示出来。想要选择一种既能提高上样量又能获得效果较为理想的电泳图谱，就要在IPG胶条的选择上做一些改进。

3.4等电聚焦电泳IPG胶条pH范围和长度的选择

商品化的IPG胶条在pH范围上有线性与非线性，宽pH梯度与窄pH梯度之分[3]。我们通过初步试验分析胰液中蛋白质总体分布情况后，发现胰液蛋白质主要集中于pH4～7梯度段之间，在酸碱两端也有少量蛋白质分布。因此，我们在胰液样品双向凝胶电泳时选用了pH3～10非线性的IPG胶条，既能检测胰液蛋白质总体分布，又能相对提高pH4～7段的分辨率，获得更多的蛋白质点。

在IPG胶条长度的选择上，通过图谱分析，我们认为，使用18 cm胶条低上样量适合于胰液蛋白质的分析，而24 cm胶条高上样量则更利于胰液蛋白质的制备。

3.5胰液相关蛋白质的鉴定

通过与前人[2]工作的比较，我们初步发现了10余种尚未报道的胰液相关蛋白质。通过后续功能研究，将有可能从中发现可直接用于胰腺疾病检测的生物标志物[7]。

我们通过一系列相关实验，得出了如下结论：第一，在低温下使用丙酮沉淀法处理胰液样品，既可以去除盐、脂等干扰物质，提高蛋白质的抽提率，还可以抑制蛋白酶的活性，减少蛋白质的修饰和损失；第二，使用商品化的IPG胶条，在选取合适的长度（18/24 cm）和pH范围（pH3~10 NL）的基础上，适当提高上样量（400~500μg），并采用考马斯亮蓝R350染色可以提高胰液双向凝胶电泳图谱的分辨率和重复性。

总之，我们对人胰液蛋白质组双向凝胶电泳的条件、标本处理等各个环节进行了调整、优化，建立了相对稳定的人胰液双向凝胶电泳技术方案，初步鉴定出部分胰液蛋白质，为建立胰液蛋白质表达谱及进一步开展疾病相关的胰液蛋白质组学研究打下了良好的技术基础。

参考文献

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[6]Wandschneider S, Fehring V, Jacobs-Emeis S, et al. Autoimmune pancreatic disease: preparation of pancreatic juice for proteome analysis [J]. Electrophoresis, 2001, 22 (20): 4383-4390.

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