肾小管上皮细胞线粒体氧化损伤在肾间质纤维化中的作用及机制

对照组，其中实验组行左侧输尿管结扎术，对照组则仅接受左侧输尿管游离，14 d后对两组大鼠的左侧肾脏中线粒体相关基因的表达情况、肾脏功能等参数进行检测分析。 结果 实验组大鼠术后14 d mtDNA（1.49±0.12）、NRF1（1.87±0.17）、PGC1a（1.76±0.21）、Drp1（2.49±0.24）、Mfn2（2.45±0.27）的表达水平均明显高于对照组（1.07±0.23、1.11±0.29、1.05±0.32、1.14±0.35、1.17±0.14），差异具有统计学意义（P<0.05）；术后14 d，实验组大鼠肾脏组织中的COX（2.61±0.27）明显高于对照组的（1.07±0.19），SOD较对照组明显降低（0.55±0.16 vs 1.07±0.18），其RIF指数（22.76±1.39）明显高于对照组的（0.81±0.16），差异具有统计学意义（P<0.05）。 结论 在肾间质纤维化中肾小管上皮细胞线粒体氧化损伤发挥着十分重要的作用，缺氧所造成的线粒体氧化损伤会造成肾小管功能受损，引起大量致纤维因子的产生，并从多途径引起肾间质纤维化。

[关键词] 肾间质纤维化；肾小管上皮细胞；线粒体氧化损伤；肾小管功能

[中图分类号] R692 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）20-0032-03

[Abstract] Objective To discuss the effect and mechanism of mitochondria oxidative damage in renal tubular epithelial cells on renal interstitial fibrosis. Methods A total of 60 health male rats were selected from a local animal experimental center from June to December 2015 and divided into study group and control group. Rats in the study group were given left ureteral obstruction， while those in the control group were only given left ureteral mobilization. Parameters including the expression of genes in mitochondria and renal function of the left kidney were detected and analyzed after 14 days. Results At 14 d after surgery， the expression levels of mtDNA （1.49±0.12）， regenerating gene （1.87±0.17）， interrupted gene（1.76±0.21）， and fusion gene（2.49±0.24， 2.45±0.27） in the study group were all significantly higher than those（1.07±0.23， 1.11±0.29， 1.05±0.32， 1.14±0.35， and 1.17±0.14） in the control group（P<0.05）. The level of COX （2.61±0.27） in kidney tissues in the study group was significantly higher than that（1.07±0.19） in the control group， while the level of SOD was significantly lower than the control group（0.55±0.16 vs 1.07±0.18）. The RIF index （22.76±1.39） in the study group was significantly higher than that （0.81±0.16） in the control group （P<0.05）. Conclusion Mitochondria oxidative damage in renal tubular epithelial cells has a significant effect on renal interstitial fibrosis. Mitochondria oxidative damage caused by anoxia may lead to functional impairment of kidney tubules， inducing a large number of fibrosis factors and resulting in renal interstitial fibrosis from multiple pathways.

[Key words] Renal interstitial fibrosis； Renal tubular epithelial cell； Mitochondria oxidative damage； Renal tubular function

绝大部分慢性肾脏疾病均存在肾间质纤维化表现，如间质细胞外基质和小管基底膜成分出现定量及定性改变、肌纤维母细胞聚集、肾小管萎缩等[1]。目前大量研究均指出，在肾小管基膜破坏过程中，患者多存在肾小管上皮细胞转化为肌纤维母细胞样细胞现象，继而引起间质区出现大量细胞外基质（engine control module，ECM）沉积，引发肾小管萎缩，最终造成间质纤维化病损[2，3]。本次研究在2015年6～12月期间通过建立大鼠模型，旨在探讨肾小管上皮细胞线粒体氧化损伤在肾间质纤维化中的作用机制。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取21日龄SD雄性成年大鼠60只，由本地动物实验中心提供，实验动物生产许可证号为SCXK2015-0002。将其随机分为对照组和实验组，实验组大鼠30只，平均体重（221.9±12.4）g，对照组大鼠30只，平均体重（216.7±13.5）g，两组大鼠的日龄、体重等一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05）。其中对照组接受左侧输尿管游离，实验组大鼠接受左侧输尿管结扎术。

1.2 方法

1.2.1 模型制备方法 实验组：取10%水合氯醛（0.03 mL/kg）对大鼠行腹腔注射麻醉，在手术台上对其行右侧卧位固定，剪除体毛后对手术区进行消毒，取左侧腹切口，将皮肤、肌肉和腹壁各层逐层切开，使左侧输尿管暴露并对其进行分离，使用5-0丝线对其进行结扎并离断输尿管，逐层缝合完成手术。对照组大鼠仅对左侧输尿管进行游离，但不进行结扎和离断。

1.2.2 检测方法 术后14 d摘取两组大鼠左侧肾脏，并对其进行处理，对下述指标进行检测：①线粒体基因表达水平：采用Real-time PCR技术度两组大鼠肾小管上皮细胞线粒体NRF1、PGC1a、Drp1、Mfn2和mtDNA（mitochondrial DNA，mtDNA）的表达水平进行检测记录；②超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、环氧酶（cyclo-oxygenase，COX）水平：采用Real-time PCR技术对两组大鼠肾脏组织中的SOD和COX水平进行检测；③肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis，RIF）指数：对大鼠肾脏组织进行Masson染色，其中胶原纤维呈绿色，对其中绿色数量进行统计；④对两组大鼠的肾组织羟脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）含量进行比较。

1.3 统计学方法

采用统计学软件SPSS18.0进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间结果比较进行t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大鼠线粒体基因表达水平比较

实验组大鼠术后14 d mtDNA（1.49±0.12）、NRF1（1.87±0.17）、PGC1a（1.76±0.21）、Drp1（2.49±0.24）、Mfn2（2.45±0.27）的表达水平均明显高于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05），提示实验组大鼠肾脏组织中的线粒体具有较高活性。见表1。

2.2 两组大鼠术后14 d肾脏指标比较

术后14 d，实验组大鼠肾脏组织中的COX明显高于对照组，SOD较对照组明显降低，其RIF指数明显高于对照组，且实验组大鼠肾体比、肾脏Hyp含量均明显高于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）。见表2。

3 讨论

慢性肾脏疾病已成为严重威胁公众健康的常见慢性疾病，此种患者多以肾纤维化作为病理基础。Huising MO等[4]研究证实，在肾纤维化早期可采取有效措施促进其逆转，特别是对于肾间质和肾小管而言，其具有自我修复功能，在一定程度上可促进肾间质纤维化的逆转。

肾间质纤维化作为多种慢性肾脏疾病的终末期病例特点，在肾脏结构破坏过程中具有十分重要的作用，会造成间质毛细血管破坏、肾小管萎缩、成纤细胞增生和肾间质中细胞外基质的积聚[5-7]。相关资料显示，肾间质纤维化主要从以下四个方面实现：细胞损伤及活化、促炎因子和致纤维化因子产生、纤维化形成、肾脏结构和功能丧失，在此过程中，肾小管上皮细胞损伤和功能不全占据着十分关键的位置[8，9]。临床研究证实，缺氧性损伤会造成肾小管上皮细胞损伤，主要由于肾小管上皮细胞具有高溶转运活性特征，对于线粒体能量供给具有较高要求，缺氧会造成线粒体氧自由基产生增多，与线粒体膜结合造成其通透性改变[10-13]。从而引起细胞色素C由线粒体进入细胞浆，引发细胞损伤途径。左侧输尿管结扎会造成肾脏组织出现血流动力学改变，引起组织发生缺氧缺血性损伤，从而导致肾间质纤维化的发生[14]。

在本研究中，通过对大鼠左侧输尿管进行结扎以模拟肾小管上皮细胞线粒体氧化损伤，通过对两组小鼠肾脏组织中线粒体的基因表达情况进行检测，结果显示实验组大鼠的mtDNA、NRF1、PGC1a、Drp1、Mfn2表达水平均明显高于对照组（P<0.05），提示在实验组大鼠中存在显著的肾脏线粒体活性增强表现，表明模型建立成功。

肾间质纤维化的形成机制较为复杂，以ECM积聚和肾间质纤维细胞增生为主要病理特征。SOD、COX作为表征肾小管上皮细胞活性的主要指标，在发生肾小管损伤时，COX和SOD水平会出现相应变化。在本研究中，术后14 d实验组大鼠的SOD水平明显低于对照组，COX则明显高于对照组（P<0.05），表明实验组大鼠存在十分显著的肾小管上皮细胞损伤，结合线粒体基因表达情况，提示缺氧所造成的线粒体氧化损伤同肾小管上皮细胞损伤之间存在密切联系。其中，氧化损伤所引起的肾小管上皮细胞损伤会造成大量致纤维因子的产生，引起ECM产生和降解失衡，从而在肾间质中出现大量ECM沉积，造成患者肾小管萎缩和肾功能减退。在众多致纤维化因子中，以TGF-β1作用最为显著。Jelakovic B等[15]研究指出，肾间质中的TGF-β1因子主要来源于肌纤维母细胞和成纤维细胞，在本次研究中，肾脏组织Masson染色试验证实，在实验组大鼠中存在明显肾间质纤维化表现，再次证实缺氧损伤会诱发肾间质纤维化。同时对两组大鼠的肾脏发育情况进行分析显示，实验组大鼠的肾体比、肾脏Hyp含量均明显高于对照组（P<0.05），与相关报道中的结论基本一致。

综上所述，本次研究从肾小管上皮细胞线粒体氧化损伤研究入手，对肾小管解离在肾间质纤维化中的作用进行分析，创新性从线粒体动力平衡、功能等方面对线粒体损伤同TGF-β1致纤维因子之间的关系进行探讨。在肾间质纤维化中肾小管上皮细胞线粒体氧化损伤发挥着十分重要的作用，缺氧所造成的线粒体氧化损伤会造成肾小管功能受损，引起大量致纤维因子的产生，并从多途径引起肾间质的纤维化。

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（收稿日期：2016-05-06）

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