不同剂量电离辐射对大肠癌ＨＣＴ－８细胞凋亡的影响

摘要： 目的：本研究通过检测不同剂量电离辐射对大肠癌细胞凋亡的影响，探讨逆转肿瘤多 药耐药的方法。方法：采用流式细胞术检测大肠癌多药耐药HCT-8细胞凋亡的变化。结果： 与假照射组相比，2Gy大剂量照射后HCT-8细胞凋亡小体百分率明显增加(P<0．01)，先 给予低 剂量照射(50mGy，100mGy，200mGy)后，再给予大剂量照射，HCT-8细胞凋亡小体百分率进 一步增加(P<0．01)，其中以100mGy+2Gy组增加明显，与单纯2Gy大剂量照射组比较， 无统计学意义。结论：结果表明大剂量辐射可以明显诱导大肠癌多药耐药HCT-8细胞凋亡。

关键词：辐射；大肠癌；多药耐药；细胞凋亡

中图分类号： R735.3+4 文献标识码： B 文章编号： 1008-2409(2008)05-0921-03

大肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，治疗以手术为主，但是大肠癌又是一种全身性疾病， 对于手术后及失去手术机会或转移性大肠癌患者均应该应用化疗、放疗等综合治疗，以提高 患者生存质量，降低复发率，延长患者生存期，提高治愈率［１］。但化疗的最大障 碍是肿瘤 细胞的多药耐药性，特别是大肠癌细胞的多药耐药(MDR)原发性高表达及继发性高表达，使 得大肠癌细胞的多药耐药性明显高于其它肿瘤，使化疗的效果明显低于其它肿瘤。本研究通 过检测不同剂量电离辐射对大肠癌多药耐药细胞凋亡的影响，探讨逆转肿瘤多药耐药的方法 。

1 材料与方法

1．1 细胞株

人大肠癌HCT-8细胞株，由卫生部放射生物重点实验室提供。细胞培养在 含10％小牛血清的RPMI1640培养液内，置37℃、5％CO2培养箱内饱和湿度培 养，0．25％胰蛋白酶消化传代。

1．2 照射条件

用国产X．S．S．250(FZ)型固定式X射线 深部治疗机照射，电压200kV，电流10mA，滤板0．5mmCu+1．0mmAl。低剂量(0．05~ 0．2Gy)全身照射，靶皮距247．3cm，剂量率0.0125Gy／min。较高剂量(2Gy)全身照 射，靶皮距56cm，剂量率0．287Gy／min。

1．3 细胞耐药模型的制备

取处于对数生长期 细胞，在无菌条件下操作。分别以35、350和 3500μg/L阿霉素(ADM)孵育3d，而 后恢复 3d，镜下观察细胞形态及数量，发现350μg/L组细胞数量适中形态完好，故以400 μg/L ADM作为HCT-8细胞耐药模型刺激浓度。取处于对数生长期细胞，在无菌条 件下操作。首先以 50μg/L ADM孵育3d，而后恢复3d，倍量(100μg/L)孵育3d，再次恢复3d ，如此反复至 浓度增至400μg/L，收取细胞待用。同时设空白对照(不加药物刺激)及一直用同 一剂量刺激组做平行对照。

1．4 照射模型的制备

将耐药细胞分为以下5组：A：假照射组；B： 大剂量组(2Gy)； C：0．05Gy+2Gy组(先给予0．05Gy低剂量照射后再给予2Gy大剂量照射，以下同)；D：0．1Gy+2Gy组；E：0．2Gy+2Gy。大、小剂量间隔4h 照射，大剂量照射后24h收取细胞待测。每组设重复样品 4个。

1．5 流式细胞术(FCM)检测大肠癌细胞凋亡

本实验采用美国B-D公司生产的FACScan流式细胞仪，激发光源为15mW氩离 子激光，波长 488nm，应用间接免疫荧光，FCM检测。将HCT-8单细胞悬液，PBS洗2次，弃 上 清，吸取细胞，注入到75％冷乙醇中固定，4℃放置过夜。从75％冷乙醇固定的HCT-8单细 胞 悬液中取1×106个细胞，PBS洗涤2次，加RNase(0．1mg／ml)100μl，37℃反应30min，P BS洗 2次，加PI(0．05mg／ml，含0．03％Triton X-100)0．5ml，4℃避光反应30min，进行FCM 检 测。凋亡小体变化数据用Lysis软件分析。每组均重复3次(n=3)。

1．6 统计学方法

研究结果以平均值±标准差 (±s)表示，两两比较采用t 检验。

2 结果

对HCT-8细胞照射，大、小剂量间隔4h照射，大剂量照射后24h收取细胞待测。将HCT -8 细胞用75％乙醇固定，采用流式细胞术(FCM)分析细胞凋亡小体百分率的变化。由表1可见 ， 与假照射组相比，2Gy大剂量照射后HCT-8细胞凋亡小体百分率明显增加(P<0．01) ，先给予低 剂量照射(50mGy，100mGy，200mGy)后，再给予大剂量照射，HCT-8细胞凋亡小体百分率进 一步增加 (P<0，01)，其中以100mGy+2Gy组增加明显，与单纯2Gy大剂量照射组比较， 无统计学意义。

3 讨论

大肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，我国大肠癌发病率有上升趋势。大肠癌治疗以手术为 主，但是大肠癌又是一种全身性疾病，虽然肿瘤被完全切除，但当原发肿瘤出现明显症状之 前可能已发生播散性转移。对于手术后及失去手术机会或转移性大肠癌患者均应应用化 疗 、放疗等综合治疗，以提高患者生存质量，降低复发率，延长患者生存期，提高治愈率。但 化疗的最大障碍是肿瘤细胞的多药耐药性，多药耐药(MDR)在人类肿瘤化疗过程中普遍存在 ，产生MDR的一个重要机制是MDR基因MDR1过度表达。特别是大肠癌细胞的MDR1原发性高表达 及继发性高表达，使得大肠癌细胞的多药耐药性明显高于其它肿瘤，使化疗的效果明显低于 其它肿瘤。

细胞凋亡是主动的、程序化的固有细胞死亡过程。细胞凋亡是许多抗肿瘤药物及放疗发 挥作用的重要环节［2］。流式细胞仪观察法是检测细胞凋亡的常用方法。本实验是 通过流式 细胞仪观察 X射线对大肠癌HCT-8细胞凋亡的影响，与假照射组相比，2Gy大剂量照射后HCT -8 细胞凋亡小体百分率明显增加(P<0．01)，表明大剂量辐射可以明显诱导大肠癌HCT-8 细胞凋 亡。细胞凋亡是受基因调控的过程，多种癌基因及抑癌基因参与了这一进程。在细胞凋亡过 程中，Bcl-2是特异性抑制细胞凋亡的存活基因［3］。研究表明大剂量电离辐射能够降低细胞凋亡抑制基因Bcl-2 mRNA转录水平，从而抑制Bcl-2蛋白表达。 抑 癌基因p53在辐射诱导的凋亡中起重要作用，野生型p53(wtp53)基因的表达可导致敏感细胞 发生凋亡，如果向已失去内源性p53功能的细胞中注入wtp53蛋白可诱导这些细胞发生凋亡， 大剂量电离辐射可增加p53 mRNA转录水平，从而增加p53蛋白表达，使细胞凋亡增多［4 ］。辐 射诱导的细胞凋亡是一个十分复杂的多基因调控过程，本实验大剂量照射后HCT-8细胞凋亡 增加考虑为多基因调控结果。

参考文献：

[1］ 李啸峰，张矛，马琳，等．54例直肠癌术后复发因素分析［Ｊ］．实用肿瘤学杂志，1995，10(4)：61-62.

[2］ ZHANG C,LUNDGREN K,YAN Z,et al.Pharmacologic properties of AG-012986, a pan-cyclin-dependent

kinase inhibitor with antitumor efficacy ［Ｊ］. Mol Cancer Ther,2007，(4):818-828.

［3］ ZECCHIN K G,SEIDINGER A L,CHIARATTI M R,et al.High Bcl-2/Bax ratio in Walker tumor cells protects mitochondria but does not prevent H202-induced apoptosis via calcineurin pathways［Ｊ］. J Bioenerg Biomembr, 2007,39(2):186-194.

［4］ NIJHUIS E H,POOT A A,FEIJEN J,et al.Hsp70 and p53-reponses after heat treatment and/or X-irradiation mediate the susceptibility of hematopoietic cells to undergo apoptosis［Ｊ］. Int J Radiat Biol,2008,84(2):99-105.

(收稿日期： 2008-05-20)

［责任编辑 高莉丽 邓德灵］

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