原癌基因pokemon的mRNA在肾癌中的表达及其意义

[摘要]目的 检测肾癌组织中pokemon的mRNA的表达，分析其与各临床病理特征间的关系。方法 收集47例肾细胞癌手术切除的癌、癌旁及临近正常组织，应用逆转录实时聚合酶链反应（Real-time PCR）检测标本中pokemon基因的表达，并对其与肾癌的临床病理特征进行分析。结果 Real-time PCR检测肾细胞癌、癌旁及正常对照组织中pokemon的mRNA表达有差异，具有统计学意义（P＜0.01）。肾细胞癌组织中pokemon的mRNA表达与肿瘤病理分级有关，而与患者的性别、年龄、肿瘤最大直径、TNM临床分期及病理学类型无明显相关性。结论 pokemon的mRNA表达和肾细胞癌的发病及恶性程度有关，可能成为肾癌治疗的有效靶点。

[关键词] Pokemon；肾细胞癌；实时聚合酶链反应

[中图分类号]R737.11 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2011）27-17-03

Expression of Pokemon mRNA and Its Clinical Significance in Renal Cell Carcinoma

HOU Liejun1ZHENG Junhua2GENG Jiang2 GU Wenyu2WANG Bo2

1.Department of Urinary Surgery, Affiliated Hospital of Ningbo University, Ningbo 315020, China; 2.Department of Urinary Surgery, Shanghai No.10 People’s Hospital Affiliated to Tongji University,Shanghai 200072,China

[Abstract] Objective To explore the expression of pokemon in human renal cell carcinoma and its correlation with clinical features. Methods Reverse transcription Real-time PCR applied to detect the expression of pokemon in 47 cases of resection samples, their corresponding paracancerous samples and normal samples. Correlation between expression of pokemon and clinical-pathological features was analyzed. ResultsThe expression of pokemon mRNA was significantly higher in the cancerous tissues than those in the paracancerous tissues and normal tissues（P＜0.01）. The expression of pokemon was related to tumor differentiation degree, but has no correlation with patient’s gender, age, maximum diameter of tumor,pathological type and TNM stages. ConclusionPokemon is expressed in human renal cell carcinoma and it may play a key role in the genesis of renal cell cancer. It may be the therapeutic target of renal cell carcinoma in the future.

[Key words] Pokemon；Renal cell carcinoma；Real-time PCR

近年发现的原癌基因Pokemon被认为是抑制多种抑癌基因从而使致癌基因发挥作用的上游关键基因，在致癌转化中起了核心作用，已有研究发现Pokemon在某些人类恶性肿瘤中存在过表达。本实验应用Real-time PCR检测Pokemon的mRNA在肾癌中的表达，从而探讨Pokemon与肾癌发病机制及临床病理特征的相关性。

1 材料与方法

1.1 标本来源

本实验标本取自上海市第十人民医院泌尿外科2010年2月~2011年2月肾肿瘤手术，且经术后HE染色病理诊断明确为肾细胞癌。经靶向治疗后行姑息性减瘤术以及伴发其他脏器原发恶性肿瘤的患者未纳入本研究。标本切取方法为：肿瘤实质内非坏死区作为肿瘤组，紧邻肿瘤假包膜以外肾组织作为癌旁组，距肿瘤最远部切下的经HE染色病理证实为非肿瘤侵犯的肾脏组织作为正常对照组。标本切下后即用液氮速冻保存，实验前转至-80℃低温冰箱。入组共47例，其中男 27例，女 20例，年龄30～76岁，中位年龄56岁。肿瘤直径≤4.1cm的24例，＞4.1cm的23例；T1期40例，T2+T3+T4期7例；有淋巴结转移43例，未发现淋巴结转移4例；未发现远处转移44例，远处转移3例；透明细胞癌33例，乳头状腺癌7例，嫌色细胞癌4例，集合管癌3例；低分化癌13例，中分化癌14例，高分化癌20例；临床分期Ⅰ+Ⅱ期41例，Ⅲ+Ⅳ期6例。患者术前均未进行化学治疗、放射治疗或细胞因子治疗。

1.2 主要试剂与仪器

RNA提取试剂TRIzol购自Invitrogen 公司，逆转录试剂盒及Real-Time PCR试剂盒购自Takara公司，2×Taq PCR MasterMix及100bp DNA Ladder购自天根生化科技有限公司，10×SYBR GreenⅠ购自Lonza Rockland公司。核酸分光光度定量仪（95801）购自GE公司，RT及PCR仪（22331）购自德国Eppendorf公司，Real-time PCR仪（7900HT Fast Real-time荧光定量）购自Applied Biosystems公司。

1.3 PCR引物

在Pubmed的Genbank中查阅Pokemon及β-actin的mRNA序列，自行设计并由上海生物工程有限公司合成。Pokemon具体引物序列为：上游5’- GAGTGCAACATCTGCAAGGTC-3’，下游5’- CATGTGGTTCTTCAGGTCGTAG -3’，产物长度141bp；β-actin具体引物序列为：上游5’- TCATCACCATTGGCAATGAG-3’，下游5’- CACTGTGTTGGCGTACAGGT-3’，产物长度155bp。

1.4 逆转录Real-time PCR检测

取出-80℃冰箱保存组织，匀浆后TRIzol法提取，依次用氯仿、异丙醇、75%乙醇分离纯化，溶于无RNase水，用分光光度计测定RNA纯度，并经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA有无降解及程度。取TaKaRa公司PrimeScript RT试剂盒，按说明书逆转录合成cDNA，根据TaKaRa公司SYBR Premix Ex Taq说明书进一步行Real-time PCR反应，具体反应体系为：2×SYBR Premix Ex Taq 5μL，Dye ROX（50×）0.2μL，cDNA 1μL，Primer (10μM)各0.2μL，dH2O 3.4μL。在Real-time PCR仪（7900HT Fast Real-time荧光定量）上设置循环参数：95°C 30s预变性，然后40个循环的PCR反应（95°C 5s，60°C 30s），最后熔解曲线分析，判断扩增特异性。以β-actin作为内参照，每个样品同时做两个复孔，获取Ct值后参考Livak, K等[1]的方法计算2－ΔΔCt值，进行统计学分析。

1.5 统计学处理

所得数据用SPSS11.0软件数据包进行统计分析，癌、癌旁和正常组织所得计量资料用随机区组方差分析统计，与各临床病理特征间的关系用t检验或单因素方差分析进行统计，两两间比较采用LSD法，计量资料以（χ±s）的形式表示。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 Pokemon的mRNA在肾癌、癌旁及正常组织中的表达差异

7900HT Fast Real-time荧光定量仪显示PCR扩增良好，溶解曲线证明扩增特异性（图1~4）。荧光定量Real-time PCR所得Ct值经2－ΔΔCt方法计算处理，随机区组方差分析提示Pokemon的mRNA在肾癌、癌旁和正常组织中表达有差异，具有统计学意义（P＜0.01）。进一步行组间比较提示mRNA在肾癌组的表达与癌旁及正常组比较差异均有统计学意义（P＜0.01），明显高于癌旁和正常组，癌旁和正常组差异无统计学意义（P＞0.05）

2.2Pokemon的mRNA与肾癌各临床病理特征间的关系

Pokemon的mRNA表达与肾癌患者的病理分级有关，而与性别、年龄、肿瘤最大直径、T、N、M、临床分期及病理类型无明显相关性。见表1。

3 讨论

近年发现的原癌基因Pokemon（又叫ZBTB7A、LRF、FBI-1），定位于人类第19号染色体短臂1区3带中的第3亚带（19p13.3），具有2个外显子和2个内含子，其编码产物是一种转录抑制因子，属于POK家族。Pokemon最初是做为HIV-1启动子的特异性结合蛋白被发现的[2]，其特殊的锌指结构能介导特异性DNA序列的识别和结合；而POZ域的主要功能是在Pokemon结构完整的前提下和BCL-6等的POZ域形成同源或异源二聚体，POZ域相互作用易于辅阻遏物结合成复合体，激活Pokemon与目标基因靶点结合，从而抑制目标基因的转录[3]。

Pokemon作为一种转录抑制因子可影响多种肿瘤相关因子的转录，从而影响肿瘤的发生发展。研究发现Pokemon强效抑制在细胞周期阻滞中起重要作用的肿瘤抑制因子Rb基因的转录[4]。Maeda等[5]发现鼠Pokemon使致癌转化中肿瘤抑制蛋白ARF水平下降，ARF表达的抑制导致了Mdm2介导的p53的稳定性或活性降低，从而刺激细胞的增殖。此即为Pokemon-ARF-Mdm2-p53通路。而Won-Il Choi等[6]的最新研究认为，Pokemon不仅抑制p53，还抑制ARF、Hdm2（人类中与鼠Mdm2同源蛋白）和细胞周期阻滞因子p21CIP1（以下简称为p21）的转录。Pokemon对p21基因甚至显示了比对p53基因更强的抑制效应。Pokemon作为ARF-Hdm2-p53-p21通路的主要控制因素，通过阻断或限制ARF到Hdm2的表达，从而调节p53的表达最终影响到p21的表达。以上研究都证明了Pokemon是抑制多种抑癌基因从而使致癌基因发挥作用的上游关键基因，因此被喻为肿瘤发生的“总开关”，在致癌转化中起了核心作用。因此，在人类肿瘤中检测Pokemon的具体表达情况将具有重要意义。

目前国内外对Pokemon在人类肿瘤中的表达研究主要涉及淋巴瘤/白血病、非小细胞肺癌、乳腺癌及消化道恶性肿瘤等领域。Pokemon在肾癌中的表达及其与肾癌临床病理特征的关系，就所查文献尚未见详细的研究和报道。本研究通过Real-time PCR方法，在mRNA（转录）水平检测Pokemon在肾癌、癌旁、正常组织中的表达情况，及其与肾癌各临床病理特征间的关系。结果显示Pokemon的mRNA在所有的组织样本中均存在表达，未发现Pokemon表达阴性的组织，且Pokemon的mRNA在肾癌、癌旁和正常组织中的表达总体有差异，具有统计学意义（P＜0.01）。经过进一步的组间两两比较发现，Pokemon的mRNA在肾癌中的表达明显高于癌旁和正常组（P＜0.01），而癌旁和正常组差异无统计学意义（P＞0.05）。上述结果显示Pokemon在肾癌中存在着异常的表达，提示其与肾癌的发生有关。王波、曹国春和徐静等[7-9]分别在肝癌、贲门癌、白血病细胞和胃癌组织中检测Pokemon的表达水平，均显示了100％的表达率，且均发现Pokemon异常高表达于恶性肿瘤，与本研究结果一致。

对Pokemon的mRNA与肾癌各临床病理特征间的关系进行统计分析显示，Pokemon的mRNA表达与病理分级有关。低分化（3.262±0.905）、中分化（2.807±0.75）和高分化（2.501±0.559）组间总体差异具有统计学意义（P＜0.01）。由均数可见低分化组的mRNA表达最高，其中，低分化组与高分化组间差异有统计学意义（P＜0.01），与中分化组差异没有统计学意义（P＞0.05），中分化组和高分化组之间差异有统计学意义（P＜0.05）。王鹏飞等[10]在大肠癌中的研究、张雨等[11]在胃癌中的研究以及李志明等[12]在非小细胞肺癌中的研究都认为Pokemon的表达和病理分级间存在相关性，具有统计学意义，与本研究结果相同。

Tsui KH等[13]根据1997年修订的TNM分期标准对643例肾癌患者的相关预后因素进行分析后认为，病理分级和TNM分期是肾癌最重要的两个预后指标，对偶然发现的无临床症状的早期肾癌研究显示，病理分级和患者存活率的相关性最大[14]。而本研究显示Pokemon的表达和病理分级有关，因此推断Pokemon在肾癌中的表达程度能预测肾癌的预后。Zhao ZH等[15]用免疫组化技术检测62例非小细胞肺癌肿瘤组织中Pokemon的表达，发现Pokemon表达阴性的患者存活率显著高于表达阳性的患者（P＜0.01），认为Pokemon的表达是一个独立的影响预后的因子（P＜0.05），和本研究观点一致。

本实验纳入的每例研究对象（患者）均在术毕按取材标准保存了癌、癌旁和正常对照3个标本，因此区组因素确定，在癌、癌旁和正常对照间统计Pokemon的表达差异时采用了随机区组方差分析，充分考虑了不同个体间的差异对统计结果的干扰，较单因素方差分析具有明显的优势，在之后的统计结果中也证明了这一点，随机区组方差分析显示不同患者间Pokemon表达的差异也具有统计学意义（P＜0.01）。

综上，Pokemon的mRNA在肾癌、癌旁和正常肾组织中普遍表达，而在肾癌中的表达明显高于癌旁和正常组，且Pokemon的表达和病理分级有关。研究结果提示Pokemon的表达和肾癌的发生密切相关，可能预测肾癌的预后。为今后利用Pokemon进行肾癌的检测诊断、预后判断、甚至基因靶向治疗提供了理论依据和新的思路。

[参考文献]

[1] Livak K. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method[J]. Methods, 2001, 25(4): 402-408.

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[3] Davies JM, Hawe N, Kabarowski J, et al. Novel BTB/POZ domain zinc-finger protein, LRF, is a potential target of the LAZ-3/BCL-6 oncogene[J].Oncogene. 1999, 18（2）: 365-375.

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[5] Maeda T, Hobbs R, Merghoub T, et al. Role of the proto-oncogene pokemon in cellular transformation and ARF repression[J]. Nature，2005， 433(7023): 278-285.

[6] Choi WI, Jeon BN, Yun CO, et al. Proto-oncogene FBI-1 represses transcription of p21CIP1 by inhibition of transcription activation by p53 and Sp1[J]. J Biol Chem， 2009，284（19）: 12633-12644.

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[11] 张雨, 余昌俊, 宋海屏. Pokemon蛋白在胃黏膜不典型增生和胃癌中的表达[J].安徽医科大学学报，2007，42（6）：641-643.

[12] 李志明, 蔡曦光. Pokemon与E2F1在非小细胞肺癌组织中的表达及意义[J].山东医药， 2009，49（16）：96-98.

[13] Tsui KH, Shvarts O, Smith RB, et al. Prognostic indicators for renal cell carcinoma: a multivariate analysis of 643 patients using the revised 1997 TNM staging criteria[J]. J Urol，2000，163（4）：1090-1095.

[14] Tsui KH, Shvarts O, Smith RB, et al. Renal cell carcinoma: prognostic significance of incidentally detected tumors[J]. J Urol，2000，163（2）：426-430.

[15] Zhao ZH, Wang SF, Yu L, et al. Overexpression of Pokemon in non-small cell lung cancer and foreshowing tumor biological behavior as well as clinical results[J]. Lung Cancer，2008， 62（1）：113-119.

（收稿日期：2011-08-05）

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