蜗牛匀浆液直肠给药对溃疡性结肠炎大鼠的保护作用

材料与方法

1.1 材料及仪器

蜗牛（自行捕捉，经鉴定为巴蜗牛科巴蜗牛属同型巴蜗牛）;冰乙酸（成都市科龙化工试剂厂，批号：2016041301），水合氯醛（成都市科龙化工试剂厂，批号：20160316），乙醚（四川西陇化工有限公司，批号：20170524），甲醛溶液（成都市科龙化工试剂厂，批号：2016033102）;通用台式离心机（赛默飞世尔科技中国公司），分析天平（Sartorius，BP211D型），优谱超纯水器（成都超纯科技有限公司，UPH-1-20T型）等。

1.2 实验动物与分组

SPF级雄性SD大鼠40只，6～7周龄，体重180～220 g，购自四川成都达硕生物科技有限公司，动物许可证号[SCXK（川）2015-030]，分笼饲养，自由摄食饮水。根据随机数字表将实验动物分为空白组、模型组、高剂量组与低剂量组，每组10只，各组大鼠造模前禁食不禁水24 h，编号称重。

1.3 蜗牛匀浆液制备

取活体蜗牛洗净外壳后，禁食不禁水静养12 h排尽粪便。将活体蜗牛去壳后，取出蜗牛组织，称量，加入适量生理盐水，用手动匀浆仪研磨均匀[12]，加入不同体积生理盐水分别稀释成0.2、0.1 g/mL，即得含蜗牛匀浆液的高剂量组与低剂量组溶液备用。

1.4 动物模型建立与给药

将水合氯醛溶液（5%）按0.7 mL/100 g腹腔注射给予大鼠，待其麻醉后，经肛门注入冰乙酸（5%）1 mL，作用30 s后，用0.5 mL生理盐水灌洗1次[13]。低剂量组和高剂量组于造模后第2天，按照0.5 g/kg大鼠、1.0 g/kg大鼠分别直肠给予蜗牛匀浆液，模型组和空白组均给予相应体积生理盐水，1次/d，连续7 d。

1.5 大鼠体征的测定

每日观察大鼠精神状态、活动情况，记录大鼠造模前和实验结束时的体重，并计算体重变化。

1.6 粪便评分

参考文献[14]拟定粪便评分标准，每日记录各组大鼠粪便情况，给出相应评分，按粪便性状的程度：正常粪便、软粪便、非定型软粪便、水样粪便、血便分别记为0、1、2、3、4分。

1.7 肠重系数测定

给药完成后，采用脱颈椎法处死所有大鼠，解剖取出自肛门往上约7 cm肠段，在生理盐水中清洗，滤纸吸干表面水分后，统一剪取5 cm肠段称重，按照下述公式计算肠重系数：肠重系数=肠重/体重×100%。

1.8 结肠组织病理学检测

将取出的各组动物肠组织，固定于4 %甲醛溶液送检（成都里来生物医学实验中心）。步骤：依次进行脱水、包埋、切片、染色、封片后，在光镜4×10倍下观察大体组织、病变，再选择要观察的区域采集400倍图片，观察具体病变[15]。对各组结肠的炎症细胞浸润、浸润深度、溃疡深度，按照溃疡性结肠炎症分级评分标准进行评分。见表1。

1.9 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件对数据进行统计分析，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，非正态分布资料采用中位数（四分位数间距）[M（IQR）]进行描述。计量资料经t检验分析，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验;计数资料和非正态分布资料经秩和检验分析，多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对大鼠体征及体重的影响

模型大鼠经蜗牛匀浆液高、低剂量组直肠给药后，食量、活动开始增加，精神状态也由萎靡状态逐渐好转。与空白组比较，模型组体重差值降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。蜗牛匀浆液直肠给药后，与模型组比较，高、低剂量组大鼠体重差值均升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

2.2 对大鼠粪便性状的影响

冰醋酸造模后大鼠表现出明显腹泻，呈现水样粪便、稀溏或黏液稠密便，甚至血便，肛周毛发被粪便污染严重。模型组粪便评分高于空白组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。给药后，高、低剂量组腹泻症状逐渐减轻，由水样型稀便转为松散型软粪便，从第4天开始，高剂量组的粪便评分低于模型组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表3。

2.3 对大鼠肠重系数的影响

与模型组比较，空白组、高剂量组和低剂量组的肠重系数均降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表4。

2.4 对大鼠结肠组织炎症的影响

用400倍光学显微镜观察，与模型组比较，高、低剂量组的结肠组织黏膜单层柱状上皮、固有层及黏膜层结构相对清晰和完整，少见变性及坏死，炎症细胞浸润深度较浅。见图1。另外，采用Kruskal-Wallis H检验，各组炎症细胞浸润、浸润深度、溃疡深度评分的分布不同，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表5。同时，采用Bonferroni法矫正显著性水平后两两比较，模型组在炎症细胞浸润、浸润深度、溃疡深度评分的分布与空白组比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）;高剂量组的炎症细胞浸润深度评分与溃疡深度评分的分布与模型组比较，差异有统计学意義（P < 0.05）。见表6。

3 讨论

现代研究表明中药蜗牛黏液已显示出较好的抗炎、促愈合作用等，如：蜗牛组织匀浆液中提取的粗蛋白对于多种致病菌和真菌显示出较高的抗微生物活性[16];蜗牛的黏液中存在多种复杂并未充分表征且不能被实验室所合成的活性天然产物[17]，在黑色素瘤的体外研究中表现出较好的抗肿瘤活性[18];另外在对黏液的粗制纯化提取物进行哺乳动物成纤维细胞定居的伤口愈合体外实验中，发现其对成纤维细胞具有促存活、增殖与迁移作用，诱导IL-8的分泌，促进伤口愈合[19-20]。同时，研究[3]表明溃疡性结肠炎的现代临床治疗采用中药特别是中药直肠给药较西药更具综合优势。

鉴于此，本研究创新性地将蜗牛匀浆液直肠给药治疗UC模型大鼠，通过对其各项体征的观察及粪便性状、体重、肠重系数、结肠组织炎症等指标的分析，发现蜗牛匀浆液可以改善模型大鼠活动，使其食量增加、精神状态好转等，并且能够改善大鼠粪便性状，降低腹泻评分;同时，蜗牛匀浆液可以通过减少结肠炎病理损伤程度来降低肠重系数和结肠炎症评分，有效控制溃疡恶化累及至结肠黏膜下层，且以高剂量组作用突出，该研究结果提示，蜗牛匀浆液直肠给药对于UC大鼠确有较好的保护作用。

本实验在蜗牛匀浆液的处理方法中，对鲜蜗牛静养排便、去壳去杂、低温保存、低温匀浆等环节进行控制，确保受试样品的活性与实验操作的可靠性。尽管结果提示采用该法制备的蜗牛匀浆液确实显示出良好的抗UC大鼠结直肠炎症损伤作用，但蜗牛匀浆液同样具备中药组成成分复杂这一共性，其用于抗炎作用的物质基础目前还不明确，可能的作用机制也不清楚。课题组将在此基础上，进一步对蜗牛匀浆液进行活性成分研究，以揭示其治疗UC的物质基础与可能机制，以期深入开发挖掘蜗牛的临床应用价值。

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（收稿日期：2019-01-13  本文編辑：封   华）

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