一起鸡坏死性肠炎与球虫病混合感染的诊疗

报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 湖北宜昌市某鸡场送检的6只63日龄发病的罗曼粉蛋鸡。

1.1.2 培养基 CW琼脂基础（含卡那霉素）、50%卵黄盐水悬液为青岛日水生物技术有限公司产品；含卡那霉素、卵黄的CW琼脂培养基按使用说明书自制；细菌微量生化反应管为杭州微生物试剂有限公司产品。

1.1.3 参考菌株 A型产气荚膜梭菌（C57-12株）、C型产气荚膜梭菌（C59-37株）购自中国兽医药品监察所；鸡源大肠杆菌由本研究室分离保存。

1.1.4 引物设计 PCR特异引物序列参照文献[5]，由生工生物工程（上海）有限公司合成，α-毒素基因、β-毒素基因预期片段分别为402、196 bp。

1.2 方法

1.2.1 病理剖检 解剖病鸡观察其病理变化。

1.2.2 球虫粪检 采用饱和盐水漂浮法。取5～10 g盲肠粪便于烧杯中，加入饱和盐水搅拌、过滤，将滤液倒入直径1.5～2.0 cm的试管中至液面凸出管口，上放盖玻片，静置30 min，平移此盖玻片至有一滴甘油的载玻片上，显微镜下观察球虫卵囊。

1.2.3 细菌的分离与鉴定 取小肠内粪便少许，接种于CW琼脂培养基，42 ℃厌氧培养24 h，选取单个疑似菌落接种于紫牛乳培养液中，42 ℃，厌氧培养6～9 h。选取单个疑似菌落涂片，革兰氏染色、镜检。并分别接种于葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、明胶、甘露醇、H2S、硝酸盐还原、蛋白胨水微量生化反应管，进行生化鉴定。

采用多重PCR法鉴定细菌毒素基因型[5]。用煮沸法抽提已分离鉴定的产气荚膜梭菌及参考菌株的模板DNA。反应体系：10×PCR Buffer 5.0 μL，dNTP 1.0 μL（10 mmoL/L），上、下游引物各1.0 μL（10 mol/L），Taq DNA聚合酶2.5 U，模板10 μL，用灭菌去离子水补足至50 μL。反应程序： 94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保温。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，对扩增的基因片段进行测序分析，PCR产物测序由生工生物工程（上海）有限公司完成。

2 结果与分析

2.1 病理剖检

病鸡剖检可见小肠胀气，肠壁增厚，肠管剪开后自行外翻，黏膜上有斑状溃疡及散在出血点，盲肠高度胀气、呈暗红色、盲肠内有血色稀便。

2.2 球虫粪检

病鸡盲肠粪便镜检可发现大量约20 μm×15 μm大小的长卵圆形球虫卵囊。

2.3 细菌的分离与鉴定

2.3.1 菌落形态 经CW琼脂培养可见圆形、微隆起、卵黄色、表面褶皱、菌落周围形成白浊环、中等大小的疑似菌落生长。

2.2.2 紫牛乳反应 分离菌株的紫牛乳反应均呈阳性，出现爆裂发酵现象，此试验对产气荚膜梭菌具有特征性的鉴别意义。

2.3.3 细菌形态观察 分离菌株经革兰氏染色后，在油镜下观察均可见大量，长4～8 μm，宽1.0～1.4 μm，单在、成双呈短链状的两端钝圆的革兰阳性、有荚膜的粗大杆菌。

2.3.4 生化试验 分离菌株葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、明胶、H2S、硝酸盐还原均呈阳性反应，甘露醇、吲哚均呈阴性反应。

根据分离菌株的菌落形态、紫牛乳反应、细菌形态、生化试验结果均符合产气荚膜梭菌特性，说明分离菌株均为产气荚膜梭菌。

2.3.5 细菌毒素基因型鉴定 多重PCR反应结果显示，从分离菌株中均可扩增出α-毒素基因片段（长度402 bp），与预期扩增的基因片段大小一致；均没有扩增出β-毒素基因片段（长度196 bp），见图1。扩增出的α-毒素基因片段序列测定结果与GenBank中已发表的产气荚膜梭菌α-毒素基因序列同源性达到99%。说明6株分离菌株毒素基因分型结果均为A型。

根据病鸡的剖检病理变化、球虫粪检及产气荚膜梭菌的分离鉴定结果，结合临床症状、诊断该鸡群混合感染坏死性肠炎和球虫病。

3 讨论

山地放养鸡易感染球虫导致肠黏膜损伤，而产气荚膜梭菌是条件致病菌，小肠粘膜损伤是重要的诱发因素，所以临床上常见鸡球虫病与坏死性肠炎混合感染[1，3，4]。鸡坏死性肠炎与球虫病一年四季皆有发生，但在气温多变、高温潮湿的夏秋季节发生较多。

鸡坏死性肠炎的病原为A型或C型产气荚膜梭菌，目前湖北省内皆为A型产气荚膜梭菌，与文献报道[2]的中国其他省份一致。球虫病肠道的病理变化和部位与球虫的种类有关，该起病例为毒害艾美尔球虫，主要为害十二指肠和小肠的中段[1，6]。

目前主要用药物防治鸡坏死性肠炎、球虫病，产气加膜梭菌及鸡球虫易产生耐药性，应定期轮换用药。鸡球虫病还可采用疫苗进行预防，但鸡球虫种类多，免疫球虫弱毒苗有一定效果，但有时未能提供坚强的保护。在饲料中添加益生素、酶制剂及中草药制剂可提高鸡肠道的健康状况，能一定程度预防该病[7-9]。

该起病例用抗球虫药及林可霉素、青霉素、酒石酸泰乐菌素抗菌药饮水5 d，疗效显著。

参考文献：

[1] SAIF Y M.禽病学[M].第十二版.苏敬良，高 福，索 勋，译.北京：中国农业出版社，2012.

[2] 陈海宁，廖申权，戚南山.鸡产气荚膜梭菌的分离鉴定及药敏试验[J].动物医学进展，2013，34（12）：228-232.

[3] 包花尔，苏秀英.父母代肉种鸡球虫病继发坏死性肠炎的诊治[J].黑龙江畜牧兽医综合版，2014（2）：58-59.

[4] 董剑峰，赵克华，罗进昌.一起肉鸡坏死性肠炎与慢性小肠球虫病混合感染的诊治体会[J].畜禽业，2015（2）：89-90.

[5] 段新华，李建军，杨学云，等.多重PCR检测产气荚膜梭茵方法的建立及其临床应用[J].中国动物传染病学报，2010，18（5）：23-26.

[6] 孙桂芹.鸡坏死性肠炎与球虫病、新城疫、流感的临床鉴别诊断[J].北方牧业，2014（10）：22.

[7] VENKAT S ，PRAKASH C S.益生菌替代抗生素控制肉种鸡坏死性肠炎的效果[J].饲料工业，2013，34（21）：29-31.

[8] 刘丽丹，吴松明，廖贵城.姜黄素肠道修复剂对鸡球虫病疫苗免疫效果的影响[J].中国兽药杂志，2015，49（2）：22-26.

[9] 王志前.鸡坏死性肠炎的诊断及综合防治措施[J].畜牧与饲料科学，2014，35（3）：86-87.

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