液质质定量并确证牛奶和其他高蛋白食品中的双氰胺

近来掺杂高含氮组份伪造高蛋白含量假象的事件，促使食品制造商和监管部门使用快速而准确的分析方法提前确定产品安全性。早在2007年，面筋粉中的三聚氰胺和三聚氰酸就导致了肾衰竭等病症的发生，引起大量猫狗死亡。2008年，中国检测部门在数种牛奶和婴儿配方奶粉中发现了三聚氰胺。这导致了成百上千的受害者及6例死亡案例，同时相关产品也在很多国家进行了召回。

为了应对三聚氰胺的污染，大量针对三聚氰胺及其同系物的检测方法被开发出来，其中包括美国食品药品监督管理局（FDA）开发的针对三聚氰酸的一些方法。

无论如何，凯氏定氮法，这种通过测定食品中氮元素含量，间接衡量蛋白质含量的传统方法，依然是最为常用的。只要食品中蛋白质的含量仍然不是直接进行测量的，唯利是图的使用含氮量高的化合物进行掺假就依旧是一个严重的问题。

检测潜在掺假物（非蛋白氮源），包括脒基脲，氰尿二氰尿酰胺、三聚氰酸、缩二脲、环丙三氨三嗪、灭蝇胺、双氰胺、三聚氰胺、三脲、尿素的方法已经被开发并验证，用以检测奶制品和蛋白样品。

我们发布一种快速、简单、灵敏的液质质方法，用以检测牛奶和其他高蛋白食品中，μg/kg级的双氰胺以及其他的高氮量化合物。

样品提取液按照以下步骤处理：

1g均值样品中加入10mL含有2%甲酸的乙腈；

充分混合，超声10分钟；离心10分钟；

转移50μL提取物至进样瓶，并加入950μL稀释 200倍。

针对严重污染的食品，可能会进行进一步的提取和稀释。

使用亲水作用色谱柱（HILIC）和一般色谱条件对目标物进行分离。液相分离使用Eksigent ekspertTM ultraLC 100系统，和Phenomenex LUNA HILIC 3μ（100×2mm）色谱柱。流动相含0.1%的甲酸和10mM甲酸铵，流速为0.2mL/min（见表1）。进样体积10μL。

AB SCIEX带有Turbo VTM离子源的QTRAP？ 5500质谱。质谱使用快速正负切换的多重反应监测（MRM）模式。选择两对离子，利用定性定量离子比率进行确证（见表2）。使用13C315N3-三聚氰胺为内标。液质质数据采用MultiQuantTM2.1软件进行处理。

结果及讨论

首先，通过双氰胺标准及基质添加，验证最低检出限（LOD）和重现性。图1展示了牛奶中2μg/kg的双氰胺色谱图，定量离子流信噪比（S/N）为54，定性离子为13。图2展示了牛奶中双氰胺添加的回收曲线（经过200倍稀释）。建议使用更高的稀释倍数，以减少单一内标难以校正的基质效应。

两对离子的回归系数均可达到或超过0.997。MRM离子丰度全部都在0.392的25%的范围之内。离子比率可以直接使用MultiQuantTM软件的自动计算并报告。

其次，本方法同样可以扩展到其他潜在污染物，如图3所示。双氰胺（保留时间，RT=2.0min），三聚氰胺（RT=4.6min），氰尿二酰胺（RT=4.7min），氰尿酰胺（RT=4.8min）使用正离子模式和三聚氰酸（RT=2.1min）使用负离子模式。使用QTRAP？ 5500快速正负切换可以实现一针进样同时检测双氰胺和三聚氰酸。

图4展示了三聚氰胺（正离子）和三聚氰酸（负离子）的标曲。所有的标曲的回归系数R均大于0.998。

值得注意的是，三聚氰酸的的添加曲线（<10μg/kg）并未过原点。

使用已开发的方法和正离子模式，检测牛奶样品的双氰胺。使用批处理软件，自动定量并进行离子比率确认。

总结

本文的数据展示了一种使用液质质，快速、简便和精准的检测牛奶和其他高蛋白食品中，双氰胺和其他高氮量化合物的方法。AB SCIEX QTRAP？ 5500系统提供了一个非常灵敏和高选择性的方法，而且仅需少量的样品前处理，节省时间从而最大化通量。

双氰胺等化合物的检测，可以使用MultiQuantTM软件进行自动计算、鉴定并报告。

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