Notch2、Jagged-2在缺氧合并高糖大鼠心肌细胞中的表达研究

材料与方法

1.1 研究对象 H9C2细胞购自中国科学院上海细胞库。进行常规细胞传代培养、冻存。本研究在体外培养的H9C2心肌细胞中进行如下实验。

1.2 研究方法 （1）本研究进行随机分组，每组细胞数量为1×106个。①H9C2组（正常组）：置于37 ℃、5% CO2的培养箱内正常培养H9C2心肌细胞;②缺氧组：置于95% N2、5% CO2的培养箱内培养，培养液正常;③高糖组：培养液中加入33 mmol/L的葡萄糖置于37 ℃、5% CO2的培养箱内培养;④缺氧+高糖组：培养液中加入33 mmol/L的葡萄糖置于95% N2、5% CO2的培养箱内培养。各组均培养72 h。（2）心肌细胞Notch2和Jagged-2 mRNA表达水平测定采用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）测定[5]。心肌细胞Notch2和Jagged-2蛋白表达水平检测采用Western Blot方法，用凝胶图像处理系统分析目标条带的光密度值[16]。

1.3 统计学处理 使用SPSS 18.0软件对所得数据进行统计分析，对数据进行One-way ANOVA分析，结果以（x±s）表示。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 H9C2心肌细胞培养 H9C2心肌细胞常规培养，倒置相差显微镜观察心肌细胞生长状态良好，形态呈长梭形，中心较圆，透明度较好，排列紧密，见图1。

2.2 各组心肌細胞Notch2 mRNA和蛋白表达水平比较 缺氧组和高糖组的Notch2 mRNA和蛋白表达水平均高于H9C2组、缺氧+高糖组，比较差异均有统计学意义（P<0.01），H9C2组、缺氧+高糖组的Notch2 mRNA和蛋白表达水平比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见图2、表1。

2.3 各组心肌细胞中Jagged-2 mRNA和蛋白表达水平比较 缺氧组、高糖组的Jagged-2 mRNA和蛋白表达水平均高于H9C2组、缺氧+高糖组，比较差异均有统计学意义（P<0.01），H9C2组、缺氧+高糖组的Jagged-2 mRNA和蛋白表达水平比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见图3、表2。

缺氧和高糖都是临床上较为常见的能够损伤心肌的因素，其中缺氧通常导致心肌细胞坏死，而高糖通常导致心肌细胞发生凋亡和心肌纤维化，二者共同作用造成心肌细胞大量减少，从而导致心脏收缩能力减弱，对心脏功能造成损伤。多项研究发现，在心肌梗死后的心肌细胞中，Notch信号通路被激活，并且与心肌细胞损伤后修复密切相关[15-16]。还有研究显示，高糖可以激活Notch信号通路，使Notch1表达升高[17]。但是关于Notch信号通路在缺氧合并高糖作用于心肌细胞的表达情况的研究较少。H9C2心肌细胞是一株可以连续传代的永生化细胞系，容易培养，实验稳定。本实验在心肌细胞缺氧和高糖共同作用下，模拟心肌梗死合并糖尿病对心肌细胞的损伤，探索Notch信号通路在这一过程中的表达情况及增强Notch信号通路对心肌梗死合并糖尿病的心肌细胞的修复作用，为探索心肌梗死合并糖尿病的治疗提供一定的理论基础。

有资料证实，心肌在缺氧性损伤后，Notch信号通路被激活，从而影响心肌细胞的增殖及凋亡等[18]。研究发现，Notch1、2和Jagged-1、2作为Notch信号通路的重要组成部分对心肌细胞发挥重要的保护作用[19]。以往研究也发现，Notch信号通路在缺氧后被激活，Notch1、2增多从而减弱Stat3蛋白发生磷酸化，增加抗凋亡蛋白Bcl-xl生成，下调线粒体凋亡蛋白Bax的表达[20]，从而减少心肌细胞的凋亡。本试验对心肌细胞H9C2在缺氧和高糖处理后的Notch信号通路表达情况进行检测发现，缺氧组和高糖组的Notch2、Jagged-2 mRNA和蛋白表达水平均高于H9C2组、缺氧+高糖组，比较差异均有统计学意义（P<0.01），证实在缺氧和高糖情况下，心肌细胞H9C2中的Notch信号通路被激活发挥修复心肌细胞的作用;同时发现缺氧+高糖组心肌细胞H9C2中的Notch信号通路部分被激活，Notch2和Jagged-2呈现高表达，同时与单纯缺氧和高糖相比，表达水平也有所降低，推测是有由于缺氧和高糖二者联合作用于心肌细胞，使心肌细胞损伤较重，Notch信号通路的代偿作用减弱，表达降低。

综上所述，本实验证实缺氧和高糖对心肌细胞产生严重的损伤作用，Notch信号通路在受损的心肌细胞中激活发挥心肌保护作用。但是缺氧合并高糖刺激心肌细胞时，由于细胞损伤严重，Notch信号通路的作用也相对减弱。当给予Notch信号通路激动剂后，Notch通路被重新激活，进而对心肌细胞进行修复。因此，Notch信号通路在缺氧合并高糖条件下的心肌细胞的修复中起到十分重要的作用，并且靶向干预Notch信号通路对心肌梗死合并糖尿病的临床治疗具有潜在的应用价值。

参考文献

[1] Fortini M E.Notch signaling：the core pathway and its posttranslational regulation[J].Dev Cell，2009，16（5）：633-647.

[2] Niessen K，Karsan A.Notch signaling in cardiac development[J].Circ Res，2008，102（10）：1169-1181.

[3] Dela Pompa J L，Epstein J A.Coordinating tissue interactions：Notch signaling in cardiac development and disease[J].Dev Cell，2012，22（2）：244-254.

[4] Pedrazzini T.Control of cardiogenesis by the notch pathway[J].Trends Cardiovasc Med，2007，17（3）：83-90.

[5] Loomes K M，Taichman D B，Glover C L，et al.Characterization of Notch receptor expression in the developing mammalian heart and liver[J].Am J Med Genet，2002，112（2）：181-189.

[6] Fukuda D，Aikawa M.Expand role of delta-like 4 mediated notch signaling in cardiovascular and metabolic diseases[J].Circ J，2013，77（10）：2462-2468.

[7] Rizzo P，Mele D，Caliceti C，et al.The role of Notch in the cardiovascular system：potential adverse effects of investigation notch inhibitors[J].Front Oncol，2015，13（4）：384.

[8] Zhang P，Yan X，Chen Y，et al.Notch signaling in blood vessels：from morphogenesis to homeostssis[J].Sci China Life Sci，2014，57（8）：774-780.

[9] Croquelosis A，Domenighetti A A，Nemir M，et al.Control of the adaptive response of the heart to stress via the Notch1 receptor pathway[J].J Exp Med，2008，205（13）：3173-3185.

[10] Li Y，Hiroi Y，Ngoy S，et al.Notch1 in bone marrow-derived cells mediates cardiac repair after myocardial infarction[J].Circulation，2011，123（8）：866-876.

[11]陈希瑶，万卓，赵桐，等.Notch信号途径对缺氧/复氧心肌细胞的保护作用[J].心脏杂志，2014，26（4）：388-392.

[12] Gude N A，Emmanuel G，Wu W，et al.Activation of Notch-mediated protective signaling in the myocardium[J].Circ Res，2008，102（9）：1025-1035.

[13] Kratsios P，Catela C，Salimova E，et al.Distinct roles for cell-autonomous Notch signaling in cardiomyocytes of the embryonic and adult heart[J].Circ Res，2010，106（3）：559-572.

[14] Patel-Hett S，D’ Amore P A.Signal transduction in vasculogenesis and developmental angiogenesis[J].Int J Dev Biol，2011，55（4）：353-363.

[15] Outtz H H，Wu J K，Wang X，et al.Notch1 deficiency results in decreased inflammation during wound healing and regulates vascular endothelial growth factor receptor-1 and inflammatory cytokine expression in macrophages[J].J Immunol，2010，185（7）：4363-4373.

[16] Foldi J，Chung A Y，Xu H，et al.Autoamplification of Notch signaling in macrophages by TLR-induced and RBP-J-dependent induction of Jagged[J].J Immunol，2010，185（9）：5023-5031.

[17] Liu L，Gao C，Chen G，et al.Notch Signaling Molecules Activate TGF-β in Rat Mesangial Cells under High Glucose Conditions[J].J Diabetes Res，2013，2013：979702.

[18] Ferrari R，Rizzo P.The Notch pathway：a novel target for myocardial remodelling therapy[J].Eur Heart J，2014，35（32）：2140-2145.

[19] Yang H，Sun W，Quan N，et al.Cardioprotective actions of Notch1 against myocardial infarction via LKB1-dependent AMPK signaling pathway[J].Biochemical Pharmacology，2016，108：47-57.

[20] Cohen L Y，Bourbonnière M，Sabbagh L，et al.Notchl antiapoptotic activity is abrogated by caspase cleavage in dying T lymphocytes[J].Cell Death Differ，2005，12（3）：243-254.

（收稿日期：2018-12-03） （本文編辑：董悦）

推荐访问:心肌 缺氧 合并 大鼠 细胞