猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定、致病性与药敏试验

摘要：从湖北省几个猪场具有严重呼吸道症状的疑似病例中，采集了肺脏、扁桃体、关节液及心包液等病料，进行了细菌的分离培养及菌落形态观察、染色镜检、生化试验、PCR检验、血清型鉴定、药敏试验及致病性试验。结果表明，分离到的8株细菌为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）。血清型分型鉴定结果为1型的6株，3型的2株。药敏试验结果显示，分离的菌株对头孢类、先锋霉素类表现较高的敏感性，为猪场用药提供了科学参考。

关键词：猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）;鉴定;耐药性;致病性

中图分类号：S858.28        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2014）21-5204-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.21.040

Isolation Identification and Medicine Sensitivity of

Actinobcillus pleuropneumoniae

TIAN Yong-xiang1，TAN Yong-qiang2，LIU Ze-wen1，GUO Rui1，DUAN Zheng-ying1，YANG Ke-li1，ZHOU Dan-na1，LUO Yong-mei 3，YUAN Fang-yan1

（1. Institute of Animal Husbandry and Veterinary， Hubei Academy of  Agricultural Sciences/Hubei Key Laboratory of Animal Embryo and Molecular Breeding， Wuhan  430064， China;2.College of  Veterinary Medicine， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China;

3. Xiangyang  Animal Health Supervision Station， Xiangyang  442110， Hubei， China）

Abstract： The samples of lungs， tonsils，joint  fluids and pericardial fluids were collected from some suspected swine with serious symptoms of respiratory in Hubei province and conducted culture and identification through colonial morphology， observation，staining microscopy， biochemistry qualification， PCR， serotyping， drug sensitivity and pathogenicity examination. The results showed that the 8 isolated strains of bacteria were identified as porcine contagious Actinobacillus pleuropneumoniae. The serotype was 6 of serotype 1 and 2 of serotype 3. Results of drug susceptibility test showed that the isolated strains had high sensitivity with cephalosporins and cephalothin. It will provide a scientific reference for farm medication.

Key words： Actinobacillus pleuropneumoniae; identification.; antimicrobial resistance; pathogenicity

猪传染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumia， PCP）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）引起的一种高度传染性呼吸道疾病，能引起猪的胸膜肺炎和肺炎等。随着养猪业的规模化、集约化发展，该病已经成为严重危害养猪业发展的主要呼吸道疾病之一[1]。根据APP生长是否需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide Adenine dinucleotide， NAD），分为两个生物型，即生物I型（NAD依赖菌株）和生物Ⅱ型（非NAD依赖型），根据APP表面荚膜多糖和脂多糖抗原性的不同，又分为15个血清型，生物I型包括血清型1-12型和15型[2]。本研究对湖北省武汉市、宜昌市等地的多个猪场采集了疑似病猪的肺脏、关节液等病料，进行了细菌分离培养及鉴定，通过分型及药敏试验，初步了解了猪场PCP的发病情况，筛选出了高敏药物，为猪场临床用药提供了依据。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  病料  病料来源于湖北省武汉市、宜昌市等多个猪场的病猪。发病猪临床表现为体温升高、皮肤发绀、呼吸困难、咳嗽、食欲减退或废绝、呈犬坐姿势等症状。对病、死猪剖检后发现纤维素性出血性及纤维素性坏死性支气管肺炎，病变区有纤维素渗出、胸膜有纤维素附着，并有邻近胸膜黏连，肺部有界限明显的脓肿。共收集肺脏、扁桃体、关节液、心包液等病料64份。

1.1.2  培养基及相关试剂  TSA、TSB培养基及NAD购自Becton公司;新生牛血清购自四季青生物工程有限公司;微量生化鉴定管、药敏片购自杭州天和微生物试剂有限公司;引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.3  标准阳性血清  1-12型APP标准阳性血清为湖北省农业科学院畜牧兽医研究所实验室制备并保存。

1.1.4  试验动物  6周龄雌性BALB/c小鼠，购自湖北省预防医学科学院。试验前检测APP抗体为阴性。

1.2  方法

1.2.1  细菌的分离培养与染色镜检  无菌条件下将患病猪的肺脏、扁桃体、关节液、心包液等涂布于TSA培养基（含终浓度10 μg/mL NAD和5%新生牛血清，下同），于5%CO2培养箱中37 ℃培养16～24 h后，进一步将疑似菌落划线接种TSA培养基上进行纯化。纯化后的菌落涂片，革兰氏染色后镜检。用30%无菌甘油冻存于-70 ℃冰箱中。

1.2.2  菌株的PCR检测及血清型鉴定  APP外毒素IV（ApxIV）存在于所有血清型中，具有种特异性的特征，设计并合成ApxIV基因截短片段引物（P上：5′-TGGCACTGACGGTGATGA-3′;P下：5′-GGCCATCGACTCAACCAT-3′）。挑取疑似APP并纯化的单菌落裂解，作为PCR扩增的模板，空白对照用等体积的去离子水代替模板，阳性对照为实验室保存的1-12型APP标准阳性血清。

血清型鉴定：采用平板凝集试验鉴定其血清型。将PCR检验为阳性的菌株接种至TSB培养基，于37 ℃培养至对数中期。用生理盐水漂洗后，制成细菌悬液。取1滴细菌悬液分别与1-12型APP标准阳性血清均匀混合，在2 min内观察结果，出现50%（++）以上凝集者为阳性，2 min内不凝集（-）者为阴性，介于上述两者之间为可疑。

1.2.3  生化试验  将分离并镜检后的菌株分别接种至不同的微量生化试管（含0.02%NAD）进行生化试验，试验项目包括乳糖、葡萄糖、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露醇、山梨醇、靛基质、甲基红、尿素酶和MR/V-P试验等，37 ℃培养24～48 h，观察并记录试验结果。

1.2.4  药敏试验  参考CLSI（Clinical and Laboratory Standards Institute）所推荐的纸片扩散法（K-B法）进行[3]。无菌条件下，挑取纯化并鉴定的单菌落于3 mL TSB培养液中，培养10～12 h后，再取菌液（稀释到1.0×108 CFU/mL）均匀涂布于TSA培养基，用无菌镊子将29种（氨曲南、环丙氟哌酸、氨苄西林、阿莫西林、苯唑西林、哌拉西林、亚胺配能、复方新诺明、左氧氟沙星、头孢吡肟、头孢西丁、头孢曲松、头孢呋辛、头孢噻肟、青霉素、氯霉素、链霉素、丁胺卡那霉素、克林霉素、万古霉素、多粘霉素B、四环素、利福平、复达欣、先锋必、先锋霉素V、呋喃妥因、氧氟沙星、诺氟沙星）药敏纸片分别平贴于培养基表面。培养24 h后，测量抑菌圈直径。并按常规药敏试验判定标准判定分离菌株对不同抗生素的敏感程度[4]。

1.2.5  小鼠致病性试验  参照文献[5]的方法，分别选取APP血清1型和3型各1株接种TSB培养基，37 ℃培养12 h，再以1∶1 000的稀释度接种于新的TSB培养基中，200 r/min培养至对数中期（OD600 nm≈0.8）。首先开展预试验：将菌液通过10倍倍比稀释到1.0×106～1.6×1010 CFU/mL，每个稀释度接种4只小鼠，每只小鼠腹腔注射菌液200 μL，持续观察5 d，统计致90%以上小鼠死亡的最低菌液剂量和致10%以下小鼠死亡的最高菌液剂量，作为正式试验的剂量界线。正式试验：菌液采用2.0～2.5倍倍比稀释（剂量范围必须涵盖预试验的界线值），每个稀释度接种10只小鼠（注射剂量及方法同预试验），观察7 d，统计各组死亡情况。根据Reed-Meunch法计算半数致死量（LD50）。另外采集死亡小鼠肺脏无菌接种TSA培养基并分离菌株，按“1.2.2”方法进行PCR扩增。

2  结果与分析

2.1  细菌的形态特征

在TSA血清平板培养24～48 h后，可看到半透明、露珠样的小菌落，直径为1～2 mm。大部分菌株产生β溶血。取典型菌落革兰氏染色后镜检，结果为革兰氏阴性菌，大多为短杆菌、球杆菌（图1）。

2.2  分离菌株的PCR鉴定及分型鉴定结果

本试验以疑似APP并纯化的单菌落裂解后为模板，通过扩增ApxIV，结果有8株扩增出约442 bp的条带（图2）。将PCR扩增结果为阳性的菌株与1-12型APP标准阳性血清进行平板凝集反应，结果（表1）显示，所分离的8株APP菌株中，血清1型的有6株，血清3型的有2株。

2.3  生化试验结果

从分离的8株APP菌株中，每种血清型挑取1株进行生化试验，其结果见表2。由表2可见，APP血清1型和3型生长均需要NAD;可发酵乳糖、葡萄糖、果糖;不发酵山梨醇、甘露醇、鼠李糖及阿拉伯糖;可水解尿素酶;甲基红、靛基质、V-P试验均为阴性。

2.4  药敏试验结果

由表3可见，APP血清1型和血清3型对药物的敏感度大致是一样的。对阿莫西林、哌拉西林、亚胺配能、头孢类抗生素、青霉素、氯霉素、万古霉素、利福平、先锋必、先锋霉素V等敏感，对环丙氟哌酸、复方新诺明、复达欣、氧氟沙星等药物中敏，对氨曲南、氨苄西林、苯唑西林、左氧氟沙星、链霉素、丁胺卡那霉素、克林霉素、多粘霉素B、四环素、诺氟沙星等药物则耐药。APP血清1型对呋喃妥因敏感，APP血清3型则表现为中敏。

2.5  小鼠致病性试验结果

分别用分离的APP菌株攻毒小鼠，7 d后小鼠死亡情况见表4。根据Reed-Meunch法计算细菌的半数致死量（LD50）。其计算公式为：

logLD50=XK-i（∑P-0.5）

式中，XK为最高对数剂量，i为相邻两对数剂量的差值;P为各剂量组的死亡率。

由表4可见，分离的APP血清1型较血清3型对小鼠的致病力要稍强。

3  小结与讨论

近年来，猪传染性胸膜肺炎成为养猪业的呼吸系统的主要传染病之一，几乎遍及全世界所有养猪国家，流行日趋严重，给养猪业造成了巨大的经济损失[6]。APP是引起猪传染性胸膜肺炎的主要病原菌，属于巴氏杆菌。但是，APP分离比较困难，为了提高APP的分离率，应尽量采集濒临死亡或者病重猪只的病料，最好在采集病料前1周停止用药。APP对营养要求较高，需要添加小牛血清和NAD。

从药敏试验结果可以看出分离到的APP血清1型和3型菌株对同种药物的敏感性无显著差异。所分离的胸膜肺炎放线杆菌对头孢类、先锋霉素类（先锋必和先锋霉素V）表现较高的敏感性，可作为本地区治疗猪传染性胸膜肺炎的参考药物;但对诺氟沙星、氨苄西林、四环素等10种药物则不敏感，这可能为猪场在使用这些抗生素时加大剂量或不规范使用所导致，值得警惕。

参考文献：

[1] 余  燕，马金友，王天有，等.猪接触性传染性胸膜肺炎的诊治[J].河南农业科学，2007（8）：107-108.

[2] 唐文山，李  昕.猪传染性胸膜肺炎研究进展[J].动物医学进展，2008， 29（2）：98-102.

[3] MATYUS S P，BRAUN P J，WOLAK-DINSMORE J，et al. NMR measurement of LDL particle number using the Vantera？ clinical analyzer[J]. Clin Biochem，2014（7）：15.

[4] 何启盖，王贵平，刘军发，等.猪胸膜肺炎放线杆菌分离鉴定及药敏试验[J].中国预防兽医学报，2003，25（5）：360-363.

[5] 刘金林.胸膜肺炎放线杆菌毒素ApxIVA的致病性及基因缺失弱毒疫苗研究[D].武汉：华中农业大学，2009.

[6] 达来宝力格.胸膜肺炎放线杆菌生物被膜突变体的筛选与生物学特性的研究[D].武汉：华中农业大学，2008.

（责任编辑  曾德芳）

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